生化与分子生物学技术原理

生化与分子生物学技术原理第1页，课件共103页，创作于2023年2月第一章核酸的基本结构和性质一.基本的化学组成经不同程度水解可获得核酸各种组成部分

核苷酸

nucleotideNt

核苷

nucleosideNs

碱基嘌呤purinePu

嘧啶pyrimidinePy

碱基三字符号AdeCytGuaThyUraNs单字符号(d)ACGTUNs,Nt,oligoNts中均为D-戊糖第2页，课件共103页，创作于2023年2月

碱基可异构化异构平衡仅H

原子位置变化

UV,NMR分析生理pH条件下,5种碱基99.99%以氨基与酮式存在。酮式烯醇式氨基亚胺第3页，课件共103页，创作于2023年2月

N-糖苷键C1

与嘧啶N1连接

C1与嘌呤N9连接

oligo表示法

polyU均聚物

poly(dA-dT)交替排列

poly(dA·dT)随机排列

polyA·2polyU按1:2结合成复合物 (三链)

第4页，课件共103页，创作于2023年2月

抗生素第二信使嘌呤霉素细胞激动素能源库辅酶第5页，课件共103页，创作于2023年2月二.糖环的折叠形式

构型(configuration)共价化合物中,各个原子在空间的相对排列关系。构型的改变涉及到共价键破坏核酸中核糖仅一种构型：β-D型

构象(conformation)化合物内可以自由转动的单键上的原子或基团,绕单键旋转或随单键扭转,产生几种不同的空间排列形式。构象的改变并不伴随共价键的破坏

第6页，课件共103页，创作于2023年2月核酸中的核糖有多种构象

核糖的五员环不处于一个平面，C1，，O，和C4’

三个原子在一个平面上，C2’

或/和C3’

偏离此平面，使核糖产生不同的构象。

•内式构象(endo)偏离平面的方向和C5’同向

•外式构象(exo)

偏离平面的方向和C5’反向第7页，课件共103页，创作于2023年2月1.信封式(Envelope,E)

糖环的C2’或C3’1个原子偏离平面的折叠

C2’-endo(2E)C3’-endo(3E)C2’-exo(E2)C3’-exo(E3)

内式外式侧视图第8页，课件共103页，创作于2023年2月2.扭转式

(Twist,T)

糖环的C2’

和C3’

两个原子都偏离糖平面,而且取方向相反的折叠。两个原子偏离糖平面的程度可以相等或不等

C2’-endo-C3’-exoC2’-exo-C3’-endo侧视图第9页，课件共103页，创作于2023年2月•存在溶液:Nt,NsC2’-endo~C3’-endoDNA:B-DNAC2’-endoA-DNA(RNA)C3’-endoZ-DNA胞苷(C)C2’-endo(反式）

鸟苷(G)C3’-endo（顺式）第10页，课件共103页，创作于2023年2月(B-formdoubleDNA)(A-formdoubleDNA)第11页，课件共103页，创作于2023年2月三.核苷的顺反构象(syn-anti

构象)

核糖和碱基以N-糖苷键连接成核苷，核苷中碱基平面绕糖苷键旋转形成核苷的顺反构象。扭转角决定核苷的构象

•存在溶液:顺反式可互换结晶:顺反式不可互换

第12页，课件共103页，创作于2023年2月第13页，课件共103页，创作于2023年2月第14页，课件共103页，创作于2023年2月C2’-endoC3’-endo第15页，课件共103页，创作于2023年2月四.核酸的修饰成分及甲基化

1948年小牛胸腺DNA分离m5dC

特点:•原有成分的衍生物

•含量少(百分之几~万分之几)•主要化学键不变

第16页，课件共103页，创作于2023年2月1.修饰碱基

60余种

UraAdeGuaCytThy

25171262•碱基上原子被其他基团取代mpom……•AA衍生物Base-CO-NH-AA•糖衍生物Base-CH2OH-糖(6C)•非嘌呤,嘧啶衍生物(tRNA)第17页，课件共103页，创作于2023年2月W异丙烯GuatRNAanticodon3’邻位Q7-去N-GuatRNAanticodon摆动位第18页，课件共103页，创作于2023年2月2.修饰核糖

RNAC2’-OH甲基化

(Nm)

抗水解

(Rnase,[OH¯])二聚体

NmpNp3.糖苷键不同

假尿苷

ψ(tRNArRNA)C5-C1’

糖苷键4.

修饰符号

m1Am7G

CmΨmm2Gm3G22.2.7第19页，课件共103页，创作于2023年2月5.分布

a.RNA~70

•mRNA(hnRNAmRNA)5’-Cap:m7GNm

分子内:m6Am5C

•rRNA原核

m5C

真核

NmmNΨ

高度修饰成分(m1ncp3Ψ)

Helacell28SrRNA65Nm(70)18SrRNA40Nm6mN

第20页，课件共103页，创作于2023年2月

•tRNA60余种分布在环区

anticodonloop高度修饰

QW

•SnRNAuRNA5’-endCapm3G2.2.7第21页，课件共103页，创作于2023年2月

•稀有碱基的形成

酶催化

-CH3

碱基交换

Q

tRNA鸟嘌呤糖苷转移酶

G34(tRNA)Q34(tRNA)QGuaN-糖苷键打断、重建

第22页，课件共103页，创作于2023年2月

b.DNA

•~10种甲基化

•形成

合成时om5dC参入

phageT2.4.6

合成后甲基化

m5dCm6dAm4dCDNA甲基化酶

S-腺苷甲硫氨酸（甲基供体）

第23页，课件共103页，创作于2023年2月6.甲基化与基因表达

a.

原核生物DNA甲基化

•限制修饰系统

•DNA甲基化与复制

E.coli

damG*ATCdcmC*CA/TGG

完全甲基化

oriC

复制活性

半甲基化

oriC

抑制复制活性

oriC,dna甲基化速度与复制循环

半甲基化

oriC

与膜结合抑制复制(抑制剂) 第24页，课件共103页，创作于2023年2月

*dam–

半甲基化产物积累第25页，课件共103页，创作于2023年2月第26页，课件共103页，创作于2023年2月第27页，课件共103页，创作于2023年2月第28页，课件共103页，创作于2023年2月

b.真核生物DNA甲基化

•

甲基化在两条链上,对称分布

真核生物

5’-mCpG-3’

植物

5’-mCNG-3’dCmdC影响DNA-蛋白质相互作用

•甲基化格式具有组织专一性

patternofmethylation

格式变化:配子发生时期,胚胎发育早 期,病毒感染格式维持:DNA甲基化酶维持配子和体 细胞甲基化状态第29页，课件共103页，创作于2023年2月甲基化格式的维持第30页，课件共103页，创作于2023年2月C*CGGCCGGCCGG甲基化格式的限制性内切酶分析第31页，课件共103页，创作于2023年2月•甲基化与基因表达鸡珠蛋白基因的组织特异性分析(MsplHpall)CpG表达(红细胞）

mCpG不表达（肾、脑……)第32页，课件共103页，创作于2023年2月

肌动蛋白(actingene)表达高速率转录

肌肉细胞

actingene actingene(CpG) (mCpG)

成纤维细胞低速率转录

第33页，课件共103页，创作于2023年2月

•Promoter-CpG-甲基化与转录

γ-globingene–200—+90有甲基化基团

mCpG转录受阻

除去部分

mCpG转录受阻

除去所有

CpG转录

5-氮胞苷抑制甲基化,瞬时去甲基化

5-NC￬

成纤维细胞

肌肉细胞

(多核,有条纹,可收缩)第34页，课件共103页，创作于2023年2月

•甲基化与小鼠胚胎发育

knockout

甲基转移酶geneC

胚胎发育早期甲基化格式变换,其后细胞内DNA维持特定的甲基化状态配子发生期,不同性别配子的甲基化格式是特定的。其区别使父母等位基因在胚胎中表达不同。下一代配子保持相同格式

Igf2geneIGF-Ⅱ胰岛素-like生长 因子依赖于父本表达

Igf2RgeneIGF-ⅡR胰岛素-like生长 因子受体依赖于母本表达第35页，课件共103页，创作于2023年2月一条X-染色体的失活第36页，课件共103页，创作于2023年2月第37页，课件共103页，创作于2023年2月

•甲基化格式的建立、维持和改变从无到有(denovo)甲基化双链相对-CpG--mCpG-确立新格式甲基化的维持脱甲基被动复制后不再甲基化主动甲基转移碱基切除修复第38页，课件共103页，创作于2023年2月

•CpG-richislands

基因组中存在异常非甲基化-CpG-顺序簇

高含量

C+G

高频率

CGdimer(10/100bp)

分布不均,长1-2kb，间隔

~100kb

非甲基化

–CpG

存在：housekeepinggenestissuesspecificgenes5’-启动子——转录区

第39页，课件共103页，创作于2023年2月腺嘌呤磷酸核糖转移酶CpG密度1/100bpCpG密度10/100bp

–100~300第40页，课件共103页，创作于2023年2月第41页，课件共103页，创作于2023年2月

1.二氢叶酸还原酶基因2.次黄嘌呤转磷酸核糖酶基因3.核糖体蛋白质基因123第42页，课件共103页，创作于2023年2月第43页，课件共103页，创作于2023年2月CGmCG第44页，课件共103页，创作于2023年2月第45页，课件共103页，创作于2023年2月抑制转录的蛋白质MeCP-1*CpG成簇MeCP-2*CpGDNA甲基化有助于基因关闭第46页，课件共103页，创作于2023年2月第47页，课件共103页，创作于2023年2月第48页，课件共103页，创作于2023年2月五.核酸及其化学组分的化学反应

1.水解反应磷酸二酯键,磷酸单酯键,N-糖苷键

a.酶水解

b.酸碱水解

•

磷酸二酯键

•酸热强酸

dA,dG0.1NHCl30mi（100°C) rA,rG1MHCl60minrC,rU12MHClO460min•碱

DNA不作用

RNA邻接基团参与效应,生成磷酸 基转移中间物,水解。第49页，课件共103页，创作于2023年2月

•

N-糖苷键碱稳定酸不稳定DNA>RNAdNs>Ns

嘌呤Ns>嘧啶Ns

第50页，课件共103页，创作于2023年2月

酸碱作用比较

DNARNA

碱

/ 2’or3’-Nt产物

酸

Pu,Py,Pu,PyNt,

多聚核糖-P碎片

碎片

磷酸二酯键

嘧啶糖苷键

稳

大

￬ ￬

定

￬

嘧啶糖苷键

磷酸二酯键

性

小 ￬￬

嘌呤糖苷键

嘌呤糖苷键第51页，课件共103页，创作于2023年2月2.β-消除反应

连接磷酸基团的

β-C原子上有强的吸电子基团存在时,引起

α-C原子和

O原子间的键断裂。

OHR–P–O–CH2–CH2–Z

(–CHO,>C=O,–HC=N<)Oα

β

DNAandRNA化学法测序主链断开第52页，课件共103页，创作于2023年2月3.碱基上反应

a.烷基化反应(-CH3)

碱基上除

PuN-9,PyN-1外,所有N和O原子

均可因亲电攻击而甲基化。

•温和(Soft)烷化剂

硫酸二甲酯甲基硫烷烷基化物

DMSMMSMeIMeNG-N7

>A-N1

>C-N3

>T-N3DMS作用于dsDNAA-N3(Me),阻止DNApol.

第53页，课件共103页，创作于2023年2月

•强(Hard)烷化剂

N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)

N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)MeN,O核酸50%磷酸酯烷化

烷化剂直接致癌

DMSG-O6:G-N7=0.004:1MNUG-O6:G-N7=0.08:1(肝

)G-O6:G-N7=0.15:1(脑

)G-N7(Me)不改变G:C配对

G-O6(Me)不影响

DNApol,但改变碱基对, GT第54页，课件共103页，创作于2023年2月

b.卤化反应

嘧啶

5位

5-FU抗癌药

卤素分子

嘌呤

8位

8-BrPu标记

c.与醛类反应碱基的环外–NH2AMP:N6-NH2GMP:N2-NH2第55页，课件共103页，创作于2023年2月

甲醛是DNA不可逆变性剂

•鉴定

ssDNAordsDNA

•破坏RNA高级结构，消除结构对电泳迁移 率的影响

d.核糖上的反应

•核糖的氧化反应

核糖的2’，3’-顺二醇被高碘酸(HIO4)氧化成顺二醛，胺催化β-消除反应，同时碱基脱落,生成磷酸，碱基和糖碎片。

5’-Nt定量测定

RNA序列测定第56页，课件共103页，创作于2023年2月

•

核糖的脱水反应酸性条件下，核糖或脱氧核糖脱水产物与试剂反应生成有色物质。可用定糖法比色测定DNAorRNA含量。

•

苔黑酚法测RNA

核糖

糠醛

•

二苯胺法测

DNA

脱氧核糖

ω-羟基

-γ-酮基戊醛-3H2O-2H2O第57页，课件共103页，创作于2023年2月六.核酸组分的分离鉴定

1.分离

a.电泳分离

NtanddNtNt(dNt)的解离及pK值

pH3.5，Nts间净电荷

差异最大.

ADP质子化状态第58页，课件共103页，创作于2023年2月

b.层析

•离子交换层析高效液相层析

(HPLC)

•稀有成分纤维素薄板双向层析

灵敏,快速,稳定。

20种

3’-Nt,22种

5’-Nt,40种

Ns,14种抗水

解

NmNpdimer.AmGp~GmAp CmUp~UmCp2.鉴定

a.标准品对照(电泳,层析)UV吸收检出吸收UV蓝紫色斑点,G蓝色荧光,D无吸收。第59页，课件共103页，创作于2023年2月

b.紫外光谱鉴定

•溶液样品在

220-290nm波长内扫描,确定

λmaxandλmin,对照参数(特定pH)。

例:pH6-7λmaxλminA260227G253223 C271250

U262230 T267236

•不同波长下吸收比值

A250/A260A280/A260A290/A260

第60页，课件共103页，创作于2023年2月

注意点:

•一般

λmax250-280,λmin220-250

吸收曲线特征与pH相关,pH1,7,12下测定。

•Base与

Ns吸收值差异大

Ns~dNs~NmNs~Nt~dNt

•Gua类在酸性时,UV下兰色荧光,光谱曲线有 肩。

•稀有成分的吸收光谱特征常不同于常见成分

第61页，课件共103页，创作于2023年2月第二章核酸的分离纯化一.细胞中的核酸

1.存在状态与蛋白质结合(除tRNA)2.分布

DNA:原核核质区真核95%核内

5%核外（mt,ct)RNA:原核胞质真核90%质(15%细胞器）

10%核第62页，课件共103页，创作于2023年2月

3.含量少,细胞干重5-15%,10ˉ15-10ˉ10g/cell4.大小

RNA104-106DaDNA＞106Da第63页，课件共103页，创作于2023年2月二.制备中注意事项保持生物学功能,具有生物活性分子完整,天然状态(未变性)1.简化步骤

2.避免高温0-4℃3.避免过酸或过碱pH5-94.防止机械剪切作用（shearing)5.防止核酸酶降解作用

第64页，课件共103页，创作于2023年2月

5.防止核酸酶降解作用

a.DNase

活性需要Me2+(Mg2+,Ca2+,Mn2+……)

螯合剂

•SSC柠檬酸三钠-NaCl•EDTA-Na2

乙二胺四乙酸钠(Me2+)•EGTA乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+特异性)b.RNase

活性不需Me2+，热稳定，回复能力强.

●

防止外源RNase污染污染源：器皿、溶液、操作者．

第65页，课件共103页，创作于2023年2月

措施

•180℃高温处理数小时

•

0.1%

DEPC（二乙基焦碳酸盐)处理

OO蛋白变性剂

C2H5–O–C–O–C–O–C2H5

共价修饰RNase

•操作者

●抑制内源RNase

尽早、彻底去蛋白

•非专一性吸附剂

RNase碱性蛋白（pI9.6）,中性pH下 静电吸附．皂土、复合硅酸盐（Macaloid）、多聚阴 离子（肝素、聚乙烯硫酸酯）．

第66页，课件共103页，创作于2023年2月

•蛋白变性剂

异硫氰酸胍、SDS（十二烷基硫酸钠）破细胞同时使RNase失活

•RNase抑制剂

RNasin465aa酸性蛋白（鼠肝、人胎盘）与RNase结合，保护RNA,不用于提取．

•核苷酸底物类似物–—竞争性抑制剂

ApUpRNaseAG2’-5’GRNaseT1第67页，课件共103页，创作于2023年2月三.核酸的分离提取总核酸目的核酸细胞器目的核酸

1.破细胞

•物理法石英沙研磨、超声、匀浆、捣碎器．

•化学法去污剂、蛋白变性剂破膜

•生化法溶菌酶、蛋白酶

动、植物材料液N2,机械破碎细菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培养细胞去污剂与蛋白酶破膜第68页，课件共103页，创作于2023年2月破膜用去污剂

•SDS

C12-H25-O-SO3Na＋0.5-2%终浓度

[Na+]≧1MSDS↓影响CsCl梯度

•Sarkosyl（十二烷基肌氨酸钠）3%终浓度

•异硫氰酸胍

•

非离子型去污剂

TritonX-100、Brij58作用温和、膜部 分破2．解聚核蛋白并除蛋白

a.去污剂核酸pI2-2.5SDS结合蛋白质浓KAc+SDS→SDS-K↓第69页，课件共103页，创作于2023年2月

b．有机溶剂酚、氯仿蛋白质变性剂酚、酚／氯仿－异戊醇、氯仿－异戊醇注意：防剪切力（振荡速度、大口吸管），处理酚（重蒸、缓冲液饱和、0.1%8-羟基喹啉）

c．ProteinaseK处理广谱,水解力强,可在SDS,EDTA存在下作用．3．核酸的沉淀

a．乙醇核酸的Na,K盐在乙醇中↓第70页，课件共103页，创作于2023年2月

•调节盐浓度：

0.1MNaCl,0.3MNaAc,2.5MNH4Ac•加2-2.5V冷乙醇（﹥95%）搅出DNA或离心↓

•70-75%乙醇洗涤去盐除尽EtOH,干燥

•溶于TE(10mMTrisHClpH8.0,1mMEDTA)•核酸浓度﹤0.1μg/ml,加助沉淀剂

•重复沉淀，补盐!

b．异丙醇

0.3MNaAc,0.6-1V

选择性沉淀DNAand大RNA,体积小，不需低温放置．沸点高，盐↓，须EtOH洗涤．

第71页，课件共103页，创作于2023年2月

4.杂质的去除

a.小分子杂质

b.多糖

•样品预处理动物饥饿 植物暗化

•选择性沉淀

•

异丙醇糖与小分子RNA不↓

•CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）

第72页，课件共103页，创作于2023年2月

CH3

|

CH3(CH3)15–N+–CH3

+NA–

/\

CH3CH3

CTANA

￬

NaNA￬(EtOH)+CTAAc（溶）

Br-0.1MNaAc70%EtOH1%CTAB-0.35MNaCl多糖溶解第73页，课件共103页，创作于2023年2月

c.RNA与DNA互为杂质

DNP溶于1-2MNaClRNP溶于0.14MNaCl

•除RNARNase(100℃,15min处理,除DNase)

•除DNARNase-freeDNase5.保存防止降解、变性措施：灭菌、低温、盐浓度、pH、EDTA……DNATEbuffer,4-–20℃,70%EtOHRNA冰冻干燥、低温第74页，课件共103页，创作于2023年2月6.纯度的初步鉴定

a.UV吸收曲线

b.UV吸收比值

DNAA260/A280=1.8RNAA260/A280=2.0

核酸的含量测定(260nm,1cm光径)1A26050μg/mldsDNA40μg/mlssDNA,RNA36μg/mloligoNtsc.胶电泳定量,定性第75页，课件共103页，创作于2023年2月四.核酸的纯化

1.超离心

a.类型

•沉降速度法被分离物质在强大的离心力场中因沉降速度不同而分离.(速度区带超离心).•沉降平衡法被分离物质在离心时因浮密度不同进行分离.(浮密度梯度or等密度梯度超离心).

•

浮密度ρ是溶剂化密度,即核酸铯盐水化物(CsCl,H2O,NA)的密度.

•

不同介质下,核酸的ρ不同.CsClρDNA=1.71;Cs2SO4

ρDNA=1.45

•pH不同,碱基结合Cs﹢量不同,ρ值不同.第76页，课件共103页，创作于2023年2月第77页，课件共103页，创作于2023年2月第78页，课件共103页，创作于2023年2月第79页，课件共103页，创作于2023年2月

沉降速度超离心沉降平衡超离心原理沉降速度不同浮密度不同梯度物质蔗糖0-70%CsCl0-7.355M

密度1-1.3470密度1-1.9052 ﹤NA密度 包含ρDNA1.71离心力场强5-6万rpm稍强3-5万rpmNA↓CsCl成梯度分子运动向管底5S小↑or↓于等密度处

16SrRNA↓(ds,ss,cc,oc,l 23S 大DNARNA)离心时间较短免于↓管底长1-2天时间过长失败不变操作制备梯度→铺样→离CsCl+样品→混匀 心→收集 →离心→收集应用RNA,ssDNA,限制性DNA

酶切片段第80页，课件共103页，创作于2023年2月

b.沉降平衡超离心法的应用

•

测ρ•

测(G+C)%ρ=1.660+0.098(G+C)%

天然、线状、dsDNA,修饰少.(G+C)%~20–80%•RNA,DNA和蛋白质的分离中性CsClρRNA1.9,ρDNA1.7,ρ蛋白1.3-1.4ρ:RNA>RNA·DNA>DNA>蛋白质

•ρ值不同的dsDNA的分离(ρ值差0.01-0.02)

影响ρ值的因素：

•(G+C)%

•甲基化,ρ￬第81页，课件共103页，创作于2023年2月

•

重原子取代ρN15>ρN14

•

重金属原子结合

Cs2SO4Ag+

GC-richHg2+

AT-rich

•碱性CsCl离心分离DNA两条互补链

dsDNA变性→pH12-12.5CsCl离心→两个 峰（两条ssDNA）变性DNA轻链（L） 重链（H）G+T比例高，ρ大

pH12下,G-N1andT-N3解离，结合Cs+多， ρ升高.第82页，课件共103页，创作于2023年2月

•

分离不同构型DNA

DNA结合具插入作用药物(溴乙锭EB),ρ值降低.cc,oc和lDNA结合药物的量不同,ρ变化不同.ccDNA结合少；oc和lDNA结合多.

纯化质粒ccDNA,除RNA,oc,lDNA和染色体 DNA.

第83页，课件共103页，创作于2023年2月2.胶电泳快速、简便、设备简单、样品用量少……a.原理核酸pI=2-2.5,pH8-8.3时,NA带负电荷.

*PipK1=1,pK2=6完全解离

*

-+NH=-NH=pK=2.4-4.4完全解离

*

-NH--N-+H+pK=9.4-10基本未解离核酸分子大小不同,荷质比相同.荷/质=n+1/n

电泳缓冲液:TAETris-NaAc-EDTApH8.3TBETris-Boricacid-EDTApH8.3

-第84页，课件共103页，创作于2023年2月

b.胶类型的选

•agarosegel0.2~50kb(恒电场)30~10,000kb(交变脉冲电场）

•PAGE5~1000bp,分辨率1bp

第85页，课件共103页，创作于2023年2月192-5-13-29-32-39-49-60第86页，课件共103页，创作于2023年2月温度(电压)对迁移率的影响盐浓度对迁移率的影响第87页，课件共103页，创作于2023年2月c.核酸高级结构对分离的影响

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分子量相同,构型不同,迁移率不同迁移率:cc>l>oc

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