流式细胞术（免疫学检验课件）

流式细胞术前言流式细胞术（flowcytometry，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，通过检测标记的荧光信号，在功能水平上对悬液中的单细胞或其他生物粒子进行高速、逐一的细胞定量分析和分选技术。FCM检测对象：细胞及其参数(如DNA含量、细胞体积、蛋白质含量、酶活性、细胞膜受体和表面抗原等)。FCM优点：具有速度快、精度高、准确性好等。第一节FCM的检测原理激光光电倍增管放大电路激光技术单克隆抗体技术细胞荧光化学技术光电测量技术电子物理技术电子计算机技术能对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选（一）流式细胞仪基本结构

包括流动室和液流驱动系统流动室

由样品管、鞘液和喷嘴等组成，是流式细胞仪的核心组件，在这里待测样品与激光相交。液流驱动系统包括压缩空气泵、压力感受器、鞘液过滤器和样品压力调节器等。1.液流系统二、细胞分析原理

流动室和液流驱动系统

作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。

FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管由激光光源、分色反光镜、光速成形器、透镜组和光电倍增管组成。流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。2.光学系统光学系统是进行实验数据的分析、存储、显示的重要组件，由计算机及相应的软件组成。作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。3.数据处理系统流式细胞仪的数据参数前向散射光侧向散射光荧光前向散射光检测器

侧向散射光检测器

在激光束的正前方，又称小角散射FSC信号的强弱与细胞的体积大小成正比，检测的是细胞或其他颗粒的表面属性在激光束的垂直方向，又称90°散射SSC信号的强弱与细胞内颗粒结构的质量成正比，用于检测细胞内部结构属性前向散射光示意图细胞大小侧向散射光示意图结构复杂程度血液白细胞散点图淋巴细胞单核细胞粒细胞荧光信号：由待检细胞上标记的特异性荧光染料受激光激发后产生。特异性荧光探针与单克隆抗体结合后，与细胞膜或细胞内的靶抗原结合，经染色后的细胞在激光的照射下，荧光染料发出比激发光波长长的荧光，检测荧光素信号的强弱就可以了解抗原表达量的多少。高度聚焦激光束

（二）细胞分析原理

单细胞悬液

特异性荧光染料标记抗体染色流动室检测区

恒定气压鞘液喷出

高压

细胞单行排列

特异性荧光

+散射光

入射光束与液柱垂直方向前向小角方向荧光信号

侧向散射光信号

前向散射光信号

荧光检测系统

散射光检测系统

前向散射光感受器

光信号光信号电信号计算机系统转换

放大

细胞分析原理

不同光信号的转换二、细胞分选原理

（一）分选的基本原理

流式细胞仪的分选是指从细胞群体中分离出感兴趣的细胞，检测的任意参数都可作为分选时指定的细胞的依据。分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应用最多的是电荷式分选。电荷式分选基本原理488nm激光+-前向散射光检测器

荧光检测器电磁场单个细胞被分类进入检测管流式细胞仪分选系统（二）FCM分选指标

细胞分选对仪器的性能要求较高分选是流式细胞仪的重要功能之一分选功能的装置较为复杂

分选指标分选速度

分选纯度

分选收获率

三、流式细胞术的特点

速度快

对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可以达到每秒数千个甚至上万个细胞灵敏度高

每个细胞上只需带有1000～3000个荧光分子即能检测出来多参数多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征精度高

在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高纯度高

可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上无害性

能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选（一）影响因素

温度

pH值

非特异荧光固定剂

四、流式细胞术定量分析的注意事项

（二）质量控制

环境要求

仪器校正

样本要求

设置对照

数据的获取和分析确保标本上机检测前的浓度为1×106/ml，细胞浓度过低可直接影响检测结果。封闭非特异性结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。荧光抗体染色后需充分洗涤，注意混匀、低速离心，减少重叠细胞和细胞碎片。注意避光染色，保证细胞免疫荧光的稳定。设置对照样品，应采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。判定结果时，应注意减去本底荧光，使免疫荧光的定量分析更准确。（三）注意事项

第二节FCM的关键技术一、FCM单细胞标本的制备

流式细胞术的测定样本必须保证是单细胞悬液，这是进行流式细胞分析的最关键的第一步。单细胞悬液大多来自生物样品，主要来源于培养细胞、血液、新鲜实体组织及石蜡包埋组织等，不同来源的样本制备单细胞悬液的方法也不同。以某一类细胞群为检测对象，因此为了减少检测时的干扰因素，常常在测定前把某一细胞群（单核细胞或血小板）从血液分离出来，制成单细胞悬液再进行标记染色。制备单个核细胞悬液的最常用方法是单次密度梯度离心法（一）外周血单细胞悬液制备

（二）培养细胞的单细胞悬液制备

悬浮生长

贴壁生长

反复吹打

分散细胞

常规洗涤

低速离心

蛋白酶消化

机械吹打

细胞脱落

低速离心

漂洗重悬

单细胞悬液

培养细胞一般是以悬浮或贴壁的方式生长将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。

最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。（三）新鲜实体组织单细胞悬液制备

该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。石蜡切片一般适宜厚度是40μm~50μm，脱蜡须彻底，获取组织后，用酶进行消化处理，消化时间不宜过长，以免细胞核被消化溶解，经过滤、漂洗后即可获得单细胞悬液。（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备

FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。目前间接免疫荧光染色已较少用；直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测，多色免疫表型分析宜采用同一品牌的试剂。二、FCM样品的荧光染色

（一）FCM常见荧光染料的种类和特性应有较高的量子产额和消光系数对488nm波长的激发光有较强的吸收能力发射光与激发光之间应有较大波长差容易与被标记的单克隆抗体结合而不影响抗体自身的特异性。理想的荧光染料需要具备：常用荧光染料的特性和应用荧光染料激发光(nm)发射光(nm)颜色应用FITC488525绿色免疫荧光PE（RDI）488575橙色免疫荧光PE-Cy5488670红色免疫荧光PE-Cy7488755深红色免疫荧光ECD488620橙红色免疫荧光PI488620橙红色DNA染色APC633670红色1.直接免疫荧光染色法

优点

操作简单，方法简便、快速特异性强，与其他抗原交叉染色较少反应中只有两种因素（细胞与抗体）参与，结果判断较简单（二）FCM荧光染色的主要方法一抗二抗2.间接免疫荧光染色法优点

敏感性高具有更广的通用性缺点

①操作步骤繁琐，干扰因素较多②易产生非特异性染色，结果判断有时比较困难多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。3.多参数分析时荧光抗体的组合标记自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所发出的荧光。每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际临床检验工作中应注意区别。（三）自发荧光流式细胞仪测定样品时，针对每个细胞都会记录各个光电器件所采集的检测信号，这些信号经过模/数电路转换后，全部结果传输到计算机中存储并分析。目前所使用的流式细胞仪为了对获取的数据更直观地进行观察和分析，多用图形化的方式对数据进行显示。第三节FCM的检测分析方法

X轴代表一维参数。以通道表示，其与光强度之间的关系依放大器的性质而定，通道右侧信号的光强度明显高于左侧，越靠右侧光亮度越强。一、单参数直方图

Y轴代表颗粒计数，反映相同荧光或散射光强度的颗粒相对数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。单参数分析只能表达具有相同特性细胞数量与光信号强度的关系。

双参数直方图是一种细胞与双测量参数的图形，X轴与Y轴分别代表一种参数。双参数信号常采用对数信号，最常用的基本表示法是用点密图来显示。如果把一个散点图分别投影到X轴和Y轴，可得到两个单参数直方图。临床实践中常以多个散点图联合分析。二、双参数直方图

X轴反映SSC的信号强弱Y轴反映FSC的信号强弱

X轴反映FITC荧光信号强弱Y轴反映PE荧光信号强弱

点图把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线代表的细胞数目越多，越密集的区域也就是细胞数目变化最快的区间。二维等高图三维坐标均为参数（散射光或荧光）而非细胞数对复杂的细胞亚群观察更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难三、三参数直方图FCM常常需要分析三个以上的参数，但软件技术能够无法显示四维空间结构。随着FCM多色荧光信号检测的发展，所得到的荧光信号和散射光信号需根据需要进行组合分析以获得所需的信息。多参数分析能够同时比较各种细胞的不同抗原表达水平，可以统计出多种数据。四、多参数组合分析

指同一张单参数或双参数直方图中根据信号的强弱来划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。Region设置2Gate设置

1指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定要分析的特定细胞群，并要求该样本的所有其他参数组合的直方图只体现该群细胞的分布情况。Region设置

Gate设置

淋巴细胞是机体免疫系统中的一群重要细胞群，是执行免疫功能和参与免疫调节的免疫活性细胞，主要分为T细胞、B细胞和NK细胞3大类。不同淋巴细胞表达的CD抗原都有独自的抗原特性，在临床疾病发生过程中对各淋巴细胞的CD抗原进行测定，对于判断机体免疫功能状态、了解免疫相关疾病的发病机制具有十分重要的意义。第四节FCM的临床应用

一、淋巴细胞亚群分析采用三色标记的单克隆荧光抗体，可对T细胞亚群进行分类。Th细胞表达CD3+CD4+CD8-Tc细胞表达CD3+CD4-CD8+

（一）T淋巴细胞及亚群分析

外周血中成熟B细胞特有的标志是BCR。成熟B细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测CD5分子，可进一步将B细胞分为B1和B2细胞，正常人外周血细胞以B2为主。（二）B淋巴细胞及亚群分析

（三）NK细胞分析

自然杀伤细胞主要的表面标志包括CD16、CD56。目前临床上常采用三色荧光抗体标记将CD3-CDl6+CD56+淋巴细胞定为自然杀伤细胞。白血病免疫表型分析是利用单克隆抗体检测白血病细胞表面和胞浆内的抗原，通过分析其表型以了解白血病细胞的分类和分期，是研究白血病分化抗原和白血病分类诊断的重要手段。白血病细胞可用造血细胞分化抗原来标记检测。可检测出具有异常表型的淋巴细胞，由此可用于对各型白血病的鉴别诊断二、白血病免疫表型分析

FAB分类CD13CD33CD11bCD14HLA-DRCD34CD117MPOM0++/---++++M1++-/+-++++M2++--++/-++M3++----++M4+++++/-+/-++M5a+++/-+/-+/-+-/+M5b++++++-/+M6+/-+/-+/--+/--+M7-+/---++?-典型AML的免疫表型特点三、免疫血液病中的应用PNH是一种以补体介导的血管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病。PNH患者其红细胞、粒细胞、淋巴细胞表面的CD55、CD59抗原明显减少或消失。临床上常常通过流式细胞术检测血细胞上CD55和CD59的表达，作为PNH的诊断和疗效的评估依据。1.PNH诊断

FCM是当前血小板研究中不可缺少的检测工具，可用于检测血小板的多项指标。对血小板相关的多种疾病诊断、治疗和预防，以及抗血小板活化