高级动物生物化学第一二三章课件

高级动物生物化学第一二三章第一篇蛋白质分子基础及其实验技术第二篇基因表达调控第一篇蛋白质分子基础及其实验技术第一章蛋白质的化学组成及其分类（1）第二章蛋白质分子结构（3）第三章蛋白质一级结构测定（4）第四章蛋白质的化学修饰（4）第五章蛋白质结构与功能的关系（2）第六章蛋白质-蛋白质相互作用(2)第七章蛋白质的制备的方法与技术（4）第二篇基因表达调控第一章原核生物基因表达的调控（10）

§1引言§2细菌对营养的适应§3组成蛋白与调解蛋白§4操纵子学说§5操纵子基因结构§6乳糖操纵子§7阿拉伯糖操纵子§8氨基酸合成的操纵子

第二章真核生物基因表达调控（12）第一章蛋白质的化学组成及其分类蛋白质是生物体现生命特征的物质基础。在生物体含有成千上万种蛋白质，各具备其特异的生物学功能：如催化功能、结构功能、收缩功能、运输和贮存功能、调节功能、免疫功能、信号传导功能等等。具有特定生物学功能的蛋白质应具有特定的结构。结构决定功能；结构改变导致功能改变。1955年，Sanger，胰岛素一级结构。上世纪80年代后，随着分子生物学技术的进步，特别是人类基因组计划的完成，人们在基因水平破译了数以千计的蛋白一级结构。蛋白质的空间结构（立体结构）主要通过现代生物物理方法，如X-光衍射、核磁共振、圆二色性光谱、紫外差光谱、激光拉曼光谱等方法进行研究。研究蛋白质的空间结构对了解蛋白与蛋白、蛋白与其他物质相互作用的过程，药物的设计等具有重要意义。一、蛋白质的元素组成组成蛋白质的元素：C（50%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S（0-3%）、其它元素微量（P、I、Mo、Cr、Zn、Cu等）；蛋白质的平均含氮量为16%，此为凯氏定氮法测定蛋白质含量的基础。二、蛋白质的基本结构单位—氨基酸组成蛋白质的氨基酸为：L--氨基酸（L-α-aminoacids)L--氨基酸（L-α-Aminoacids)CRCOOHHH3N+CCH2OHCHOHHOL--甘油醛（L-Glyceraldehyde)

蛋白质中常见氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine

脂肪族氨基酸氨基乙酸氨基酸的结构

脂肪族氨基酸甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine-氨基丙酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine

脂肪族氨基酸-氨基异戊酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine

脂肪族氨基酸-氨基异己酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸Ileucine

脂肪族氨基酸-氨基--甲基戊酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline

亚氨基酸-吡咯烷基--羧酸，吡咯啶--甲酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸（蛋氨酸）Methionine

含硫氨基酸-氨基--甲硫基丁酸氨基酸的结构

甘氨酸

Glycine丙氨酸

Alanine缬氨酸

Valine亮氨酸

Leucine异亮氨酸

Ileucine脯氨酸

Proline甲硫氨酸

Methionine半胱氨酸

Cysteine含硫氨基酸-氨基--巯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine-氨基--苯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine-氨基--对羟苯基丙酸氨基酸的结构

芳香族氨基酸苯丙氨酸Phenylalanine酪氨酸Tyrosine色氨酸TryptophanTrp-氨基--吲哚基丙酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine-氨基--胍基戊酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine赖氨酸

Lysine，-二氨基己酸氨基酸的结构

碱性氨基酸精氨酸

Arginine赖氨酸

Lysine组氨酸

Histidine-氨基--咪唑基丙酸氨基酸的结构

天冬氨酸Aspartate

酸性氨基酸-氨基丁二酸氨基酸的结构

天冬氨酸Aspartate谷氨酸

Glutamate

酸性氨基酸-氨基戊二酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine

含羟基氨基酸-氨基--羟基丙酸氨基酸的结构

丝氨酸

Serine苏氨酸

Threonine

含羟基氨基酸-氨基--羟基丁酸氨基酸的结构

天冬酰胺Asparagine

含酰胺氨基酸-酰胺基-

-氨基丙酸氨基酸的结构

天冬酰胺Asparagine谷酰胺

Glutamine

含酰胺氨基酸-酰胺基--氨基丁酸根据氨基酸R基团的不同，将氨基酸分为五类：Nonpolaraliphaticaminoacids:

甘GlycineGlyG丙AlanineAlaA脯ProlineProP缬ValineValV亮LeucineLeuL异亮IsoleucineIleI蛋MethionineMetM2.Aromaticaminoacids:

苯丙PhenylalaninePheF酪

TyrosineTyrY

色TryptophanTrpW

3.Polar,unchargedaminoacids:

丝SerineSerS苏ThreonineThrT半胱CystineCysC天酰AsparagineAsnN谷酰GlutamineGluQ4.Positivelychargedaminoacids赖LysineLysK组HistidineHisH精ArginineArgR5.Negativelychargedaminoacids天冬Aspartate

Asp

D

谷Glutamate

Glu

E

蛋白质氨基酸（20种）酸性氨基酸天冬氨酸谷氨酸碱性氨基酸赖氨酸组氨酸精氨酸中性氨基酸极性氨基酸非极性氨基酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰氨谷氨酰胺甘氨酸丙氨酸亮氨酸异亮氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸色氨酸脯氨酸颉氨酸分类Ⅰ单纯蛋白质（如清蛋白、球蛋白、组蛋白、谷蛋白、等）结合蛋白质（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金属蛋白等）分类Ⅱ：按生物学功能可将蛋白质分为酶、调节蛋白、结构蛋白、转运蛋白等等；分类Ⅲ分类Ⅳ纤维状蛋白质（一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、丝蛋白、肌球蛋白等）球状蛋白质（可溶性好。典型的有：胞质酶类等）膜蛋白（与细胞的膜系统结合而存在）单体蛋白质（寡）多聚蛋白质蛋白质的分类第二章蛋白质的分子结构一、蛋白质的一级结构：蛋白质的一级结构指多肽链氨基酸的排列顺序。在蛋白质分子中，氨基酸是以肽键形式连接起来的。肽键是由一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱水形成的酰胺键。

肽键二肽

Rgroup氨基端（N端）羧基端（C端）氨基酸残基（residue）肽键蛋白质分子在结构上可分为：一、二、三、四级结构。一级结构又称为化学结构；二--四极结构称为空间结构或构象。构型与构象的概念：构型(Configuration)：分子中各原子特有的空间排列。这种排列的改变涉及到共价键的生成与破坏，与氢键无关。如顺反异构（顺-，反-）、旋光异构（D-，L-）。构象(Conformation)：分子中由于单键的旋转而产生的原子空间排列。这种排列的改变仅涉及氢键等次级键得生成遇破坏，不涉及共价键的生成与破坏。蛋白质分子中原子或基团的空间排列叫蛋白质的分子构象。蛋白质构象的形成是由于单键的旋转而引起的。蛋白质多肽链主链上的共价键都是单键结构，如果所有的单键都可以自由旋转，多肽链将有无数个构象。但实际上某一特定的多肽链在一定条件下常形成一种或少十几种构象。可见蛋白质主链上的单键并不都能自由旋转。经过X-光衍射证明：在普通有机化合物分子中，C-N单键的键长：14.9nm；C=N双键的键长：12.7nm；肽键的C-N单键的键长：13.2nm由此可见，肽键中的C-N键长介乎于普通C-N和C=N之间。它虽然是单键，却具有部分双键的性质，不能自由旋转。这样与C-N相连的4个原子：两个C、一个H和一个O与C-N位于一个平面上，这个平面被称为酰胺平面或肽键平面。由于此平面可塑性差，又称为刚性平面。二、蛋白质的分子构象：肽键平面是蛋白质构象的基本结构单位，在肽链中，相邻的肽键平面可以围绕碳原子自由旋转形成多种状态的立体结构。多肽链有规律的盘绕、折叠而形成的空间结构叫蛋白质二级结构。包括-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲。维持二级结构的化学键为氢键。三、蛋白质的二级结构（Secondarystructure）（一）-螺旋(-helix)肽链中相邻的肽键平面通过-碳原子进行旋转，盘绕而成的右手双螺旋结构叫-螺旋。Inprotein,theαhelixisamajorstructuralmotifinSecondarystructure.ItwasfirstpostulatedbyLinusPauling,(Chemist1901-1994，USA,Two-timewinneroftheNobelPrize）RobertCorey,andHermanBransonin1951basedontheknowncrystalstructuresofaminoacidsandpeptidesandPauling'spredictionofplanarpeptidebonds.-螺旋(-helix)

在α-helix中，每一圈含有3.6氨基酸（即每个氨基酸旋转100o），肽键平面与螺旋轴平行，氨基酸侧链（R基团）分布在螺旋外侧；相邻螺旋之间靠链内氢键连接（即一个氨基酸残基（n）的N-H的H与前第四个（n+4）残基的C=O之间形成的氢键（N-H…O=C）。Theaminoacidsinanαhelixarearrangedinahelicalstructure,about50nm(5Å)wide.Eachaminoacidresultsina100°turninthehelix,andcorrespondstoatranslationof15nmalongthehelicalaxis.Thehelixistightlypacked;thereisalmostnofreespacewithinthehelix.Allaminoacidside-chainsarearrangedattheoutsideofthehelix.TheN-Hgroupofaminoacid(n)canestablishahydrogenbondwiththeC=Ogroupofaminoacid(n+4).某些R基团对-螺旋的形成和稳定性有很大影响：A.酸性氨基酸（特别是Glu）或碱性氨基酸（Lys、Arg）集中的区域，(pH=7)由于同性电荷相斥，不利于-螺旋的形成；B.较大氨基酸（Phe,Ile,Try）集中的区域,由于空间位阻会影响其稳定性；

C.脯氨酸和甘氨酸

是-螺旋破坏者（Disruptor）,在-螺旋中很少发现有这两个氨基酸的存在。Someaminoacids(calledhelixbreakers)likeprolineandglycinewilldisruptthehelicalstructure.Ordinarily,ahelixhasabuildupofpositivechargeattheN-terminalendandnegativechargeattheC-terminalendwhichisadestabilizinginfluence.Asaresult,αhelicesareoftencappedattheN-terminalendbyanegativelychargedaminoacid(likeglutamicacid)inordertostabilisethehelixdipole.Lesscommon(andlesseffective)isC-terminalcappingwithapositivelychargedaminoacidlikelysine.αheliceshaveparticularsignificanceinDNAbindingmotifs,includinghelix-turn-helixmotifs,leucinezippermotifsandzincfingermotifs.Thisisbecauseofthestructuralcoincidenceoftheαhelixdiameterof120nmbeingthesameasthewidthofthemajorgrooveinB-formDNA.多肽链中的两个或多个区域充分伸展、平行排列而形成的片层结构叫β-折叠。平行排列分为顺式和反式。反式稳定。片层之间靠氢键维系（即一条链的N-H的H与相邻条链的C=O之间形成的氢键（N-H…O=C）；侧链位于片层的上下。如丝心蛋白含较多的这种结构。(二)β-折叠（β-sheet）Theβsheet(alsoβ-pleatedsheet)isacommonlyoccurringformofregularsecondarystructureinproteins,firstproposedbyLinusPaulingandRobertCoreyin1951.Itconsistsoftwoormoreaminoacidsequenceswithinthesameproteinthatarearrangedadjacentlyandinparallel,butwithalternatingorientationsuchthathydrogenbondscanformbetweenthetwostrands.Theaminoacidchainisalmostfullyextendedthroughoutaβstrand.TheN-HgroupsinthebackboneofonestrandestablishhydrogenbondswiththeC=Ogroupsinthebackboneoftheadjacent,parallelstrand(s).Thecumulativeeffectofmultiplesuchhydrogenbondsarrangedinthiswaycontributestothesheet'sstabilityandstructuralrigidityandintegrity.Theα-Catomsofadjacentstrandsstand350picometres(0.35nm)apart.

顺式β-折叠反式β-折叠(三)β-转角（β-Turns)肽链的主链某一区域发生的180度转弯的结构。附：（一）超二级结构:是指二级结构单元相互聚集形成更高级的有规律结构：1.复绕α-螺旋（coiled-coilα-helix):2.βxβ-单元（

βxβ-unit):两条3.β-迂回（β-meande):三条或三条以上4.β-折叠筒（β-sheetbarrel):多条卷成圆筒状5.α-螺旋-β转角-α-螺旋：（二）结构域（structuraldomains):一条多肽链在超二级结构的基础上，形成相对独立的几个球状区域，并以松散的肽链，这种区域叫结构域。结构域往往与功能域相对应。(四)无规则卷曲指在蛋白质分子中所有原子的空间排列。即在蛋白质二级结构的基础上，由于氨基酸残基侧链的相互作用，肽链进一步卷曲、折叠形成的立体结构或三维结构叫蛋白质三级结构。具有生物活性的蛋白质必须具有三级结构。侧链的相互作用可以形成各种次级键，以维持蛋白质三级结构的空间构象。次级键包括：疏水键、盐键、氢键、范德华引力、二硫键。其中疏水键、二硫键是主键。四、蛋白质的三级结构（tertiarystructure）胰岛素三级结构有些蛋白质是由两条或两条以上的具有独立三级结构的多肽链通过次级键聚合而成的，具有独立三级结构的多肽链称为亚基（亚单位）。蛋白质的四级结构就是组成蛋白质的各个亚基的空间排列。亚基可以相同，也可以不同。如血红蛋白，2β2亚基。主要的键为盐键。实际上好多蛋白质在发挥生理作用时常以二聚体或多聚体的形式存在。如膜上的受体。五、蛋白质的四级结构（Quaternarystructure）Inbiochemistry,manyproteinsareactuallyassembliesofmorethanoneprotein(polypeptide)molecule,whichinthecontextofthelargerassemblageareknownasproteinsubunits.Inadditiontothetertiarystructureofthesubunits,multiple-subunitproteinspossessaquaternarystructure,whichisthearrangementintowhichthesubunitsassemble.Enzymescomposedofsubunitswithdiversefunctionsaresometimescalledholoenzymes,inwhichsomepartsmaybeknownasregulatorysubunitsandthecoreisoftencalledthecatalyticsubunit.Examplesofproteinswithquaternarystructureincludehemoglobin,DNApolymerase,andionchannels.Otherassembliesreferredtoinsteadasmultiproteincomplexesalsopossessquaternarystructure.Examplesincludenucleosomesandmicrotubules.Changesinquaternarystructurearecalledconformationalchanges.Itisthroughsuchchanges,whichunderliecooperativityandallosteryin"multimeric"enzymes,thatmanyproteinsundergoregulationandperformtheirphysiologicalfunction.Theabovedefinitionfollowsaclassicalapproachtobiochemistry,establishedattimeswhenthedistinctionbetweenaproteinandafunctional,proteinaceousunitwasdifficulttoelucidate.Morerecently,peoplerefertoprotein-proteininteractionwhendiscussingquaternarystructureofproteinsandconsiderallassembliesofproteinsasproteincomplexes.血红蛋白四级结构肌红蛋白三级结构第三章蛋白质一级结构测定1955年,F.Sanger等分析了牛胰岛素一级结构§1、蛋白测序的基本策略、步骤及注意事项一、测序策略用两套方法将肽链专一性切开，各自获得一系列片段，分离纯化片段，对片段测序，最后将两条片段组合，得到全序列。二、测序的一般步骤断开多肽链内的二硫键测定每一肽链的氨基酸组成鉴定多肽链的N-末端和C-末端确定二硫键的位置裂解多肽链为较小的肽测定各肽段的氨基酸序列利用重叠肽重建完整多肽链的一级结构拆分多肽链测定多肽链的数目三、测序注意事项1.样品纯度：要求95%以上。纯度检查方法：电泳、离子交换层析、N-端氨基酸分析、Westernblot等；2.蛋白分子量测定：方法：SDS，沉降系数；3.蛋白亚基数目：方法：SDS，用还原性上样buffer；4.蛋白质氨基酸组成：氨基酸自动分析仪或水解蛋白后做氨基酸双向层析；5.糖蛋白的确定：6.蛋白质末端氨基酸分析：§2、蛋白质氨基酸的组成分析首先将蛋白质水解成游离氨基酸，再通过氨基酸自动分析仪分析蛋白质的氨基酸组成。

一、蛋白质的水解1.HCl水解法：5.7MHCl，105-110oC密封水解24-72h。通过此法水解，Trp被破坏；Ser、Thr被缓慢分解，但通过测定不同水解时间的量，可倒推水解初期的量；Cys被氧化。所以先氧化成稳定的磺基丙氨酸后再水解；Gln和Asn酸水解时脱酰胺后全部变为Glu和Asp,水解时放出的NH3可用来测定Gln和Asn的总量；Met水解时被氧化为甲硫氨酸砜，损失20%，需要校正。

2.磺酸水解法：是非氧化性强酸，用于代替HCl。方法：4M甲基磺酸，0.2%β-吲哚基乙胺（水解剂）。此法操作比较复杂。3.酶水解法：比较温和，专一性强，受水解的氨基酸不被破坏（如Trp、Asn、Gln）；缺点是蛋白不易彻底水解。

用氨基酸自动分析仪分离和测定各种氨基酸的含量。此类仪器属于离子交换层析系统，柱的填充材料为磺酸型聚苯乙烯阳离子交换树脂，在pH2时，全部氨基酸结合在树脂上，提高pH和离子强度，可以将氨基酸一次洗脱下来，从而达到分离目的（酸性氨基酸先下来，碱性氨基酸最后下来）；洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应呈紫色，可在570nm比色测定。目前有多种型号的氨基酸自动分析仪，如日立835-50型氨基酸自动分析仪分析的图谱为：二、氨基酸的分离与定量测定

测定每条多肽链的氨基酸组成三、特殊氨基酸的测定（一）色氨酸（Trp)由于酸水解Trp被破坏。常用方法有：紫外吸收法：由于TrpandTyr在280nm~290nm有吸收，所以可用完整的蛋白质进行Trp的测定。已知Trp的摩尔消光系数：288nm=4815；280nm=5690Tyr的摩尔消光系数:288nm=385;280nm=1280

Trp/Tyr=(A288×1280)-(A280×385)}/{(A280×4815)-(A288×5690)

由于Tyr氨基酸残基数可以测得，所以用Trp/Tyr比值就可以推算出Trp的量。2.对-二甲基氨基苯甲醛法：

Trp强酸醛有色物质（590nm)（二）巯基测定

方法有：硫醇盐法、烷基化法和比色法等，由于比色法简便，被广泛应用。1．5,5-二硫代双（-2-硝基苯基酸）（也叫Ellman试剂）

5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoicacid

）（DTNB）：2Pr-SHPr-S-S-Pr+（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2NCOOHHSNO22(CNT)（三）二硫键的测定

1.Ellman试剂法

（DTNB）SCOOHSNO2HOOCO2N（DTNB）COOHSNO2O2NSCOOH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+COOHHSNO2（CNT）Pr-S-S-Pr+COOHSNO2O2NSCOOHPr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2+Pr-SH+Pr-SH（Protein）Pr-S-S-COOHNO2+（CNT）COOHHSNO2Pr-SHPr-S-S-PrCOOHSNO2O2NSCOOH2+++3Pr-S-S-COOHNO2COOHHSNO2（CNT）总反应：Pr-S-S-COOHNO2碱--HN-CH-CO--CH2SCOOHSNO2--HN-C-CO--CH2+SCOOHHSNO2+（CNT）实际测定时，将蛋白质溶于2M硫氰酸胍和3mMEDTA中，先用DTNB试剂测定释放的CNT数，然后再将这个溶液pH调到10.5，再测定CNT释放的数量，二硫键的数目可用下列公式计算：二硫键的数目=（pH10.5后测得的CNT数）－2（pH10.5前测得的CNT数）2如果蛋白质没有活泼的巯基，可加入含巯基的化合物：Cys,GSH,DTT（四）氨基的测定

测定蛋白质和肽中的氨基常用：

2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）比色法：与伯胺定量反应，分光光度法测定。荧光胺法：§3末端氨基酸的测定一、N-末端氨基酸的测定主要为化学方法。共同特点是：在N端引入一个标记性基团，后分离、鉴定带有这种基团的氨基酸衍生物。（一）二硝基氟苯法（DNFB）（一）二硝基氟苯法（DNFB）NO2O2NF+H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3（DNFB）HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3NO2O2NFHHN-CH-COOHR1RNO2O2NnH2N-CH-COOH+蛋白-二硝基氟苯衍生物（DNP-Protein）DNP-氨基酸（黄色）氨基酸混合物蛋白质

除DNP-Arg外，其它氨基酸生成的DNP-氨基酸都可用乙醚抽提出来，然后用双向纸层析，用标准DNP-氨基酸比较，取下色斑，用1%NaHCO3洗脱，360nm波长比色进行定量。酸水解

（二）丹磺酰氯法（Dansyl-ClorDNS-Cl）Dansyl-Cl是一种荧光试剂，能专一地与N-端α-氨基反应，生成DNS-肽,经酸水解后得到DNS-氨基酸和其它游离氨基酸。（DNS-Cl）NCH3CH3SO2Cl+H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3蛋白质HClNCH3CH3SO2-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3（DNS-Protein）酸水解NCH3CH3SO2-HN-CH-COOHR1各种游离氨基酸（DNS-AA）DNS-AA在紫外线下有强烈荧光，灵敏度高，比二硝基氟苯高100倍，而且水解产物不需要提取，样品可直接进行纸层析。此方法已被广泛应用于N-端氨基酸分析。（三）异硫氰酸苯酯法（PITC）：此法是Edman1950提出的，也称Edman降解法。最大优点是可以连续降解，所以成为蛋白质氨基酸序列测定的基本原理和方法。（见后）

常用肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析。多肽与肼在无水条件下加热（100oC)，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。二、C-末端氨基酸的测定H2N-NH2(肼）H2N-CH-CO-NH…………CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOHR1R(n-1)RnH2N-CH-CO-NHNH2+NH2-CH-CO-NHNH2+H2N-CH-COOHR1R(n-1)Rn§4肽键的专一性裂解和肽段的分离纯化由于用Edman降解法测定氨基酸序列，一次只能连续降解数10个残基。用手工方法最多能测20个氨基酸残基。所以需要将大肽裂解成小肽，然后分别对其测序。裂解要求切点少，专一性强，收率高。裂解方法主要有：化学法和酶法裂解时，一般先将二硫键还原，并用烷化剂使其烷基化，从而不会重新氧化成二硫键。（一）蛋白质的化学裂解一、肽链的专一性裂解化学裂解的产物片段较大，适合在自动序列分析仪上测定，同时也利于肽段的吻合。1.溴化氰裂解：溴化氰能专一裂解蛋氨酸残基羧基的肽键，产率达85%。….-NH－CH－C－NH－CH－CO-….CH2CH3CH2S‖O….-NH－CH－C－NH－CH－CO-….CH2CH3CH2S‖OCN+Br-CNBr－RRCH3-S-CN….-NH－CH－C=NH－CH－CO-….RCH2CH2O+….-NH－CH－C=OCH2CH2OH2ONH2－CH－CO-…..RN-端侧肽高丝氨酸内酯C-端侧肽用此法裂解Met-X肽时，X的性质可影响裂解速度，特别是含羟基的氨基酸会干扰反应，应加大溴化氰的浓度（500：1）；在酸性条件下，可引起其它肽键裂解，特别是Asp--Pro2.亚碘酰基苯甲酸裂解法：打开Trp-X的肽键。3.X-Cys键的裂解：常用两种试剂：2-硝基5-硫氰苯甲酸（NTCB）和（2-甲基）-N-1-苯磺酰-N-（溴乙酰）醌二亚酰胺（Cyssor)4.羟胺裂解：裂解Asn-Gly肽键。5.Asp-Pro键的裂解：在稀酸溶液中就可断裂。（二）蛋白质的酶法裂解优点：专一性好，不易破坏氨基酸。常用的酶：胰蛋白酶：Lys(Arg)—X胰凝乳蛋白酶：专一性较宽，但对疏水AA—X

裂解好胃蛋白酶：芳香AA（Leu)—X

二、肽段的分离纯化及纯度鉴定（一）分离纯化根据肽段的大小、电荷、极性、溶解度等不同可以选择：凝胶过滤、离子交换、薄曾层析、毛细管电泳等但现在常用高压液相色谱法（HPLC）。（二）纯度鉴定样品中只有一条肽。N-端氨基酸分析只有一种氨基酸为纯品§5肽段的序列测定一、手工序列测定技术：化学法和酶法（一）Edman化学降解法此法比较有效，是最基本的方法。所用试剂是异硫氰酸苯酯（PITC）H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3N=C=S异硫氰酸苯酯（PITC）（肽）在碱性（pH9-9.5）下进行偶联反应-H

N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R1R2R3N-C‖S异硫氰酸苯酯肽（PTC-肽）NH-CCSNHCH-R1=ONH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-…..R2R3+2-苯胺基-5-噻唑啉酮衍生物（PTZ）在强酸条件下裂解

在HCl,80oC下转化NCCSNHCH-R1=‖O3-苯基-2-乙内酰脲（PTH-AA）进行下一轮循环反应上述反应得到的PTH-AA稳定，可用薄层层析、气相色谱、回水解法（即用酸水解PTH-AA，将其中的氨基酸释放出来，再用氨基酸分析仪测定），即得到氨基酸序列的第一个残基。裂解步骤产生的少了一个AA残基的肽可以进行下一轮循环，这样可以得到第二个、第三个……….等氨基酸。（二）DNS-Edman法

是Edman的改良方法。灵敏度较高，但酰胺和Trp不易检出。（三）酶降解法

利用外肽酶1.氨肽酶法2.羧肽酶法

羧肽酶A:释放除Pro,Arg,Lys外所有C-端氨基酸残基（牛胰脏）．

羧肽酶B：只释放Arg,Lys碱性氨基酸C-端氨基酸残基（猪胰脏）．羧肽酶Y：20种氨基酸全释放（面包酵母）二、自动序列分析为减轻手工测序的烦琐劳动，提高每次循环的收率，基于Edman反应原理，人们研制了氨基酸序列分析仪。有三类序列仪：液相、固相和气相。§6由已知序列的肽段建立蛋白质一级结构一、重叠肽（接头肽）

用至少两套切肽链的方法，得到两套以上的肽段及其各肽段的氨基酸排列顺序，然后根据两套肽段的重叠区域，就可以查出蛋白质的整个氨基酸排列顺序。二、二硫键位置的确定在测定一级结构时，肽链二硫键都是用烷化剂保护的。在测出一级结构后，需要确定哪几个Cys形成二硫键。方法：直接用蛋白酶（内切酶）水解原来的蛋白质，保留二硫键的完整性，然后找出含二硫键的肽（用对角线电泳法），再将这个肽的二硫键拆开，分别测定两个肽的序列，将这两个肽段的序列与原来的一级结构对比，就可以找出相应的二硫键的位置。对角线电泳法：用蛋白酶水解原来的蛋白，得到一系列肽段（包括含二硫键的肽段）后，先进性第一向电泳，将产物分开；再用还原剂（碘乙酸等）处理，将二硫键打开，在进行第二向电泳，电泳条件与第一向完全相同。选取偏离对角线的样品(多肽或寡肽），即为含二硫键的肽。如果二硫键在一条肽链内存在，而且在该肽链中另有一个Cys,则应该在未拆开二硫键之前，将14C-碘乙酰胺封闭，二硫键不参与此反应，这样可以确定哪两个Cys参与二硫键的形成。如果一条链有两个二硫键，常常用两个酶酶切得到含二硫键的肽。三、酰胺基位置的确定在测定蛋白质基团时，如果测出有酰胺基的存在，就要在测序后确定酰胺的位置。即确定第几位的Asp或Glu是酰胺化的。确定方法有三种(略)第三章蛋白质的修饰

蛋白质修饰的概念比较广，广义上讲，凡是肽链在体内合成后经过的体内或体外的一系列变化都成为蛋白质修饰。我们要介绍的是体外的蛋白质修饰。主要包括：

化学修饰:包括蛋白质侧链修饰和蛋白质肽链胶联荧光标记酶标记生物素标记放射性标记亲和标记其它§1影响蛋白质化学修饰的主要因素一、影响蛋白功能基反应性的因素主要包括蛋白功能基的反应性和修饰剂的反应性

蛋白质氨基酸分布情况是：中间核心是疏水aa，表面是亲水性aa。分子表面的特点不仅影响功能基的理化特性，也影响化学试剂的接近。所以要考虑微区对功能基反应性的影响。

微区的极性和空间位阻是影响功能基反应性的重要因素。功能基反应性较复杂。如：某些侧链基团与个别试剂反应性非常强，叫功能基的超反应性。影响超反应性的因素很复杂如：pK值功能基的亲和性静电吸附使试剂正确取向微区主体化学的适应性试剂结合一、影响修饰剂反应性的因素1选择吸附：2静电相互作用：带电的修饰剂易与蛋白质表面相反电荷的部位的基团反应。3位阻因素：4催化因素：局部功能基有时起酸碱催化作用，影响修饰作用。5局部极性：§2蛋白质化学修饰的方法修饰剂和修饰条件是影响修饰专一性的主要因素。一、修饰专一性的控制

1.试剂的选择：

修饰基团和修饰目的不同，所用的试剂是不同的。例如：（1）修饰所有氨基、修饰暴露的氨基、修饰具有催化活性的氨基，目的不同应选用不同的条件；(2)改变蛋白质带电状态：引入大电荷量的试剂；（3）修饰后利于蛋白质定量：引入光吸收试剂等等。选择修饰剂要考虑的问题:(1)修饰程度；(2)专一性；(3)反应限度；(4)修饰后构象变化（应该不变或少变)；(5)反应需要可逆性；(6)分析方法建立情况等。2.反应条件的选择：

不造成蛋白质不可逆变性（温度、pH、介质、离子活性高)；(2)有利于专一性修饰3.反应的专一性：

反应专一性非常重要。控制方法：利用被修饰蛋白活性部位的特殊结构（空间结构）影响某些基团的活性。如：二异丙基氟磷酸酯（DFP）能与胰蛋白酶活性丝氨酸作用，导致酶迅速失活，但在同样条件下不能使其它酶，如胰凝乳蛋白酶作用，这就是“位置专一性”。选择不同的pH影响功能基的解离，使其利于修饰。亲和标记（有特殊的亲和力）是实现专一性修饰的重要途径。试剂结构常与蛋白（如酶）的底物或抑制物相类似。在作用前，试剂先与蛋白活性部位非共价结合，然后再发生化学作用进行共价连接，将试剂挂到活性部位的基团上。这种方法在研究酶活性部位上特别有用。如用对甲基苯磺酰氯能够作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。(4)差别标记：在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它保护着蛋白活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用，只有活性部位以外的基团有可能被修饰。然后将底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带有放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质的活性基团。§3蛋白质侧链修饰一、氨基的修饰（主要是赖氨酸的ε-NH2）可分为三类：引入正电荷修饰；电荷消失修饰；引入负电荷修饰。1.引入正电荷的修饰：甲基乙亚酰胺脒

Pr－NH2H2NCR’OR+=R’OHPr－NH-C-R

=++H2N+2消除电荷修饰：抑制赖氨酸的ε—NH2质子化如：乙酰化、甲氨酰化和芳基化。Pr－NH2+H2SO3OCOCO－CH3‖pH>7C－CH3O－CH3Pr－NH+CH3COOH乙酸酐Pr－NH2+H2NCOPr－NH-CO-NH2甲酰胺三硝基苯磺酸（TNBS）O2NSO3HNO2NO2Pr－NH2+O2NNH－PrNO2NO2+黄色物质，367nm，用于定量测定蛋白质的氨基量3引入负电荷的修饰：包括乙酰化和磷酸吡哆醛修饰Pr－NH2+OCOC－CH2O－CH2pH>7Pr－NH-CO-CH2-CH2-COOHPr－NH2+NCH2-O-PHHOH3CCHONaBH4NCH2-O-PHHOH3CCH2-NH-PrNPHHOH3CC=N-PrCH2-O-二、精氨酸胍基的修饰CH3-CO-CO-CH3，CO-CO-CH3H-CO-CO-H具有两个相邻位羰基的化合物能与精氨酸胍基形成稳定的杂环产物。常用试剂：丁二酮、苯乙二醛、乙二醛。2H2OPr-NH-CNNRN=C=NH-R’CHCHOO==CHCHPr-NH-C‖‖NHNH三、羧基的修饰：试剂有碳二亚胺‖‖

Pr-COONR’-C-NHR

OH‖

Pr-CORN=C=NH-R’==四、巯基的修饰：蛋白质的巯基很活泼，很多试剂可以与其反应，有三类试剂：1碘乙酸，碘乙碘胺等。2马来酰亚胺或马来酸酐3有机汞试剂，如：对氯汞苯甲酸1类试剂属于烷化剂。产物相当稳定，易于分析，目前已经开发出很多带有荧光的碘乙酸衍生物。它们也能与Met、Lys、His反应。2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物。N—乙基马来亚胺，反映专一性强，产物在300nm处有吸收峰。3类试剂对巯基专一性最强。常用对氯汞苯甲酸，产物在280nm吸收峰1.Pr-SHICH2COOH2.Pr-SH+3.Pr-SHpH>7Pr-S-CH2-COOH+N-CH2-CH3=O=OpH>5Pr-SN-CH2-CH3=O=O+HCl-COOHCl-Hg-Pr-S--COOHHg-五、组氨酸咪唑基的修饰：常用试剂：焦碳酸二乙酯和碘乙酸CH3-CH2-OH+CO2Pr-CH2

HNHNICH2COOH+Pr-CH2

N-CH2-COOHNCH2-COOH+Pr-CH2

HNHN+=OOC-O-CH2-CH3C-O-CH2-CH3==OOPr-CH2

HN-C-OCH2-CH3N产物在240nm处有最大吸收，可用光谱追踪反应和定量测定碘乙酸

焦碳酸二乙酯六、色氨酸吲哚基的修饰：1.N—溴琥珀酰亚胺（NBS）2.2—羟—5—硝基苄基溴九、丝氨酸羟基的修饰：甲苯磺酰氯（PMSF）七、酪氨酸酚羟基的修饰：四硝基甲烷（C(NO2)4)八、甲硫氨酸甲硫基的修饰：碘乙酸等常用主要修饰剂的专一性试剂醋酸酐酰基酸酐修饰侧链醛四硝基甲烷N-溴琥珀酰亚胺碳二亚胺苯异硫氰三硝基苯磺酸焦碳酸二乙酯碘乙酸环乙烯亚胺苯甲磺酰氯LysGluCysArgSerHisTyrTrpMet×××××××××××××××××××××××××××××××××马来酰胺§4蛋白质肽链交联有些试剂具有两个功能基团或反应部位。可以使两个相隔较近的氨基酸残基间进行搭桥，从而形成多肽链或多肽间的交联，而不引起蛋白质构象的重大变化。这种试剂称为双功能试剂。这一技术常用于蛋白质构象和蛋白质间相互作用的研究。、设计或选择交联剂要考虑的因素1.反应的专一性现在大多数交联剂能与蛋白质氨基或巯基反应。根据反应类型，交联剂分两类：同型双功能试剂Pr—NH2↔H2N—Pr；Pr–SH↔HS—Pr异型双功能试剂Pr—NH2↔HS—Pr2.交联距离交联距离是一个重要参数。随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性也随之增加。用一系列具有类似专一性，但跨度不同的交联剂，可获得关于基团空间方位的大量信息。肽链间进行交联时，必须使用跨度最短的交联剂，否则得不到肽链间的交联。3.可裂解性研制可裂解的交联剂有助于分离交联片段。在这种交联剂的两个功能基之间，含有交联后可在温和条件下被裂解的区域。利用这一特点，结合双向电泳，可以很容易地分离和分析交联的组分。可裂解型不可裂解型二、交联剂的类型同型双功能试剂异型双功能试剂可被光激活试剂反应基团反应基团间隔基团同型双功能基团-(CH2)n-;非裂解CH3-O-C-=NH2+CH3-O-C-=NH2+-(CH2)n-

S-S-(CH2)n-;可裂解异型双功能基团CH3-O-C-=NH2+与氨基反应与氨基反应-S-S-N与巯基反应-(CH2)n-;非裂解=OOH(-CH-C-)2可裂解光活化双功能基团N3OH-(CH2)n-;非裂解=OOH(-CH-C-)2可裂解-S-S-NCH3-O-C-=NH2+光照活化，但没有专一性1研究蛋白质的折叠2分子间的交联，稳定蛋白质3测定蛋白质亚基的数量（SDS—PAGE）4其它三、交联剂的应用亲和标记又称部位专一性标记，专一性强，是一种特异的化学修饰方法。他是利用酶与底物的亲和性，使用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进行共价标记。由于这类的试剂对蛋白质某些特殊部位有亲和性，所以成为“亲合试剂”亲合试剂分为：内生亲和试剂:试剂本身某部分通过化学方法转化为所需反应基团外生亲和试剂:试剂+反应中的基团→外生亲和试剂一、内生亲和试剂如ATP是许多酶的底物，用过碘酸氧化ATP，核糖部分的2，3－键打开，形成含二醛的ATP衍生物。

§5亲和标记O15432OHOHCH2NNNH2

NNH123456789OAdenosine-5-monophosphate(ATP)PPPHIO4O15432CHOCHOCH2NNNH2

NNH123456789O(O-ATP)PPPO-ATP的两个醛基与酶的氨基或巯基作用形成烯夫碱，通过NaBH4还原后，产生不可逆的失活酶，用硼氚化物还原烯夫碱，则得氚标记衍生物。另外ATP,ADP,GTP,NADP都可制成二醛化合物。将卤代烷衍生物连于腺嘌呤N6上生成外生亲和试剂二、外生亲和试剂：O15432OHOHCH2NNNH-CH2--NH-CO-CH2-Br

NNH123456789O

N-6-对-溴乙酰胺-苄基-ADPPP-COOHCl-Hg-测定蛋白质中某种氨基酸的数量。2.在蛋白质序列分析中的应用

3.在研究蛋白质立体结构中的应用

•确定某些基团在蛋白质中的位置：表面的氨基酸基团易与试剂作用，而埋藏在里面的氨基酸基团不易与试剂作用。

•测定蛋白质分子中特定基团的距离。这可通过双功能试剂对多肽链交联来实现。

•研究蛋白质溶液的构象：由于侧链的反应性是由其所处环境控制的，反过来讲，反应性反映了基团所处的环境。4.确定氨基酸残基的功能。5.在蛋白质免疫化学研究中的应用

•放射免疫测定：用放射性同位素标记抗原或抗体，用以检测抗体或抗原。如用同位素I标记蛋白质分子中的Try侧链。

§6蛋白质化学修饰的应用主要是在酶工程方面的应用：•提高酶的稳定性（如:固定化技术）•改变酶的专一性如木瓜蛋白酶经过黄素溴酰衍生物处理产生具有氧化还原酶活性的黄素木瓜蛋白酶•创造新的酶活性:6.在生物工程中的应用•酶标免疫测定：用戊二醛将酶与抗体结合，标记后的酶标抗体具有结合抗原的活性和酶的活性，酶催化效率高，有放大信号的作用。有关酶和抗体的标记下一节专门介绍。抗体(IgG)标记可采用酶、荧光染料、生物素、及有色金属金。一、酶标记常用的酶有：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和半乳糖苷酶（Lac）。酶标抗体已广泛应用于：ELISA,Western-blot（蛋白免疫印迹），细胞与组织免疫化学的免疫染色过程。1.辣根过氧化物酶（HRP）标记:过碘酸盐法HRP是糖蛋白在NaIO4作用下，将糖链中的羟基氧化成醛或羧基，生成的醛可以与抗体的氨基结合，形成希夫碱，再用NaBH4还原成稳定的“酶—抗体复合物”。§7抗体标记实例1.AP标记：戊二醛法AP与IgG偶联可通过戊二醛一步交联法来完成，效果较好。半乳糖苷酶可用戊二醛一步法或间位—马来酰亚胺苯—N—羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）偶联法来交联。HRP与抗磷酸酪氨酸抗体偶联：Amersham公司提供用荧光染料标记抗体（或蛋白）后，可以发出特定波长的光。这样可直接地观察抗原和抗体的反应。这是细胞和组织化学免疫染色、荧光显微镜观察和流式细胞仪分析等过程的基础。常用的荧光染料有：荧光素（fluorescien）、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明等。下面介绍：二、荧光染料标记1.异硫氰酸盐衍生物：异硫氰酸荧光素（fluorescienisothiocyanatcFITC）罗丹明异硫氰酸盐(rhodamineisotholyanale)四甲基罗丹明异硫氰酸(tetramethyrhtdamineTRITC)方法：A.制备lg容量的凝胶粒、凝胶排阻上限为20000~50000，直径约为50μm,用PBS平衡。B.用0.1M碳酸钠（pH9.0）,配制大约2mg/mlIgG溶液。C.取1mgFITC或者TRITC溶于1ml无水高纯度二甲基砜中（用前配置），取50μl，在搅拌下分10次缓慢加入到1ml的IgG溶液中，将其放暗处8h(4℃)D.加入NH4Cl至50mM,8h(4℃),再加二甲苯兰至0.1%和甘油5%。E.用凝胶过柱分离标记和未标记的抗体。(先脱下的第一个峰为标记的，再脱洗液中加入0.02%叠氮呐和1%BSA,4℃避光保存。三、生物素标记蛋白质（酶或抗体）与小分子生物素偶联后，并不会改变生物活性，反而可提高检测灵敏度。近几年来生物素—抗生物素蛋白（亲和素）系统已经成为一种很有效的检测系统。将亲和素（抗生物素蛋白）用酶标记后，再与生物素—IgG复合物结合，可大大提高灵敏度。广泛用于ELISA,免疫印迹，组织免疫化学流式细胞仪。如：生物素标记抗体：许多生物素是先制备成生物素琥珀酰亚胺酯（SuccinimideecterofGiotin）(可直接买)然后用于标记。

•取10mgN—羟基琥珀酰亚胺—生物素，溶于1ml二甲亚砜（DMSO）中。•取1~3mgIgG溶于1ml0.1M硼酸钠Buffer(pH8.8)。如果IgG中已加了NaN3时，则必须用透析法将其除去。•按照25~250μg生物素衍生物对1mgIgG比例混合，混匀，置室温4h(全部抗体可被高浓度的生物素标记)。•加1MNH4Cl(250μg生物素需此液20μl)到上述反应液中，室温10min。•用PBS透析，以除去游离的生物素，透析48h，生物素标记的抗体可保存于-20℃。蛋白质测序的重要方法N-末端测定二硝基氟苯（DNFB）法：肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽，最后水解生成黄色DNP-氨基酸丹磺酰氯（DNS）法：用DNS取代DNFB，生成DNS-氨基酸苯异硫氰酸（PITC）法：生成PTH-氨基酸，从肽上断裂下来氨肽酶法：外切酶，但效果不好C-末端测定肼解法：测定C-末端的最重要的化学方法，肽与肼反应，除C-末端氨基酸游离外，其他氨基酸转变为氨基酸酰肼化物还原法：C-末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的α-氨基醇羧肽酶法：最有效、最常用羧肽酶A羧肽酶B羧肽酶C羧肽酶Y二硫键的断裂过甲酸氧化法：将二硫键氧化成磺酸基巯基化合物还原法：将二硫键还原成巯基，然后用烷基化试剂如碘乙酸保护巯基，防止其重新被氧化氨基酸组成的测定：酸水解：是主要方法，多用HCl，同时辅以碱水解；所得氨基酸不消旋，但Trp全部被破坏，Ser，Thr，Tyr部分破坏，Asn和Gln的酰氨基被水解，生成Asp和Glu；多肽链的裂解酶裂解：胰蛋白酶：专一性强，断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键糜蛋白酶：断裂Phe，Trp，Tyr，Leu等疏水氨基酸的羧基端肽键嗜热菌蛋白酶：专一性差，断裂Val，Leu，Phe，Tyr，Trp等氨基参与形成的肽键胃蛋白酶：在酸性条件稳定，肽键两侧均为疏水氨基酸。在确定二硫键位置时，常用到此酶。其它酶：略化学裂解：溴化氰（CNBr）：只断裂Met的羧基形成的肽键羟氨（NH2OH）：在pH9时，专一性断裂Asn-Gly之间的肽键，其它条件下不专一肽段的氨基酸测序Edman化学降解法：用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基酸，并可用各种层析技术分离；用此法降解，一次可连续测出60-70个氨基酸残基的序列；工作量大，操作麻烦；现改用蛋白质测序仪。酶解法：利用氨肽酶和羧肽酶，局限性大，有困难质谱法：质谱仪由核苷酸序列推定法：mRNAcDNA，推出cDNA的核苷酸序列，然后推测出蛋白质的氨基酸序列肽段在肽链中次序的确定：需借助重叠肽。

重叠肽：由于不同的断裂方法即断裂的专一性不同，产生的切口彼此错位，使两套肽段正好跨过切口而重叠的肽段；获得重叠肽需要两种或两种以上的不同方法断裂同一多肽样品，得到两套或多套肽段。二硫键位置的确定：一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。一是胃蛋白酶专一低，切点多，得到含有二硫键的肽段较小，易分离鉴定；二是在酸性条件下，有利于防止二硫键发生交换反应。蛋白质的氨基酸序列与生物功能；肽合成同源蛋白质：在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称同源蛋白质。同源蛋白质具有共同的进化起源。同源蛋白质具有明显的氨基酸序列相似性，称之为序列同源。根据同源蛋白质的氨基酸序列资料可建立系统树（进化树）。两个物种的同源蛋白质，其序列中氨基酸的差异数目与这些物种间的进化发生差异是成比例的。蛋白质激活：在生物体内有些蛋白质是以前体形式合成，不具有活性，只有按一定方式裂解除去部分肽链后才具有生物活性，称之为蛋白质激活。如酶原激活。肽的人工合成：氨基酸共聚合（由一种或两种氨基酸反应）控制合成（由不同氨基酸按一定顺序）：接肽反应需接肽试剂，为避免接肽试剂与某些活泼基团反应，故在接肽前须首先将这些基团加以封闭或保护，如氨基保护或羧基保护等。在正常条件下，羧基和氨基之间不会自发形成肽键，即氨基或羧基需活化，通常是羧基活化。固相肽合成：是控制合成技术的巨大进步，利用固相肽合成仪已成功合成多种肽和蛋白质。其实质是肽的羧基端第一个氨基酸共价挂接在树脂上，然后加入氨基受保护的第二个氨基酸并发生缩合反应，形成肽键，依次类推。最后是肽与树脂断裂并去掉氨基端的保护基团。Ⅲ蛋白质的三维结构研究蛋白质构象的方法：至今研究蛋白质三维结构的成就主要是应用间接的X-射线衍射法；研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法（了解）。稳定蛋白质三维结构的作用力非共价键（次级键）氢键范德华力疏水作用：突出地位离子键（盐键、静电引力）共价键：二硫键，重要作用蛋白质的二级结构无规卷曲

β转角β折叠片α螺旋：最常见、最典型、最丰富的二级结构元件α螺旋：是重复性结构，每圈螺旋站3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴上升0.54nm，即螺距值；由氢键封闭的环为13元环；一般为右手螺旋；分子内或链内氢键使之稳定，减少R基间的相互作用或β-碳原子无分支结构均利于其稳定，而Pro存在可中断之。非重复性结构β折叠片：为重复性结构；β折叠片的肽链处于曲折的伸展状态；借助链间或肽段间的氢键而稳定；分为平行和反平行β折叠片，平行的比反平行的更规则。纤维状蛋白质：动物体的基本支架和外保护成分，分子具规则的线性结构。纤维状蛋白质不溶性（硬蛋白）可溶性蛋白角蛋白胶原蛋白：结缔组织中（骨、皮肤等）大量存在弹性蛋白：存在于结缔组织α角蛋白：主要存在于毛发中β角蛋白：天然存在于丝中其它肌球蛋白血纤蛋白原其它说明：

α角蛋白经充分伸展后可转变成β角蛋白，即β折叠片结构。球状蛋白质：

其种类远比纤维状蛋白质多，蛋白质结构的复杂性和功能的多样性主要体现在球状蛋白质；球状蛋白质的整个肽链没有均一的二级结构，但具有多种二级结构元件如α螺旋、β折叠片、无规卷曲等，由此构建的三级结构—结构域，并将球状蛋白质分成4大类；其三维结构具有明显的折叠层次，且疏水测链球状分子内部，亲水侧链暴露在分子表面；在多数的胞内酶、血浆蛋白及蛋白类激素都属于球状蛋白质。超二级结构：由若干相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成种类不多，有规则的二级结构串，并在多种蛋白质中充当三级结构的构件，称为超二级结构。已知有3种基本形式：αα、βαβ、ββ。结构域：在多肽链上由二级结构元件或超二级结构形成的相对独立的紧密球状实体，是三级结构的局部折叠区。较小的球状蛋白质或亚基是单结构域，而较大的球状蛋白质或亚基是多结构域。结构域可分4类：全α结构、α，β结构、全β结构和富含金属或二硫键结构域。蛋白质变性与蛋白质折叠蛋白质变性：天然蛋白质分子在受到理化因素的作用时导致溶解度降低、不对称性增高、生物活性丧失及理化特性改变，此过程称之为蛋白质变性。蛋白质变性的实质是分子中次级键被破坏，引起天然构象解体。变性不涉及