GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用-课件

GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用

1ppt课件前言2ppt课件

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)一直被认为是一种慢性进展的血管壁脂质沉积性疾病。近些年的研究逐渐阐明了炎症在AS病理过程中的重要作用。炎症学说认为，炎症可导致不稳定斑块形成，斑块破裂甚至急性冠状动脉综合症（acutecoronarysyndrome,ACS）等临床严重并发症的发生。而不稳定斑块的重要特征之一就是斑块内血管新生。斑块内血管新生与斑块不稳定之间的关系已逐渐成为当前研究的热点。

3ppt课件

血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的过程，见于许多生理和病理情况。血管新生的过程极其复杂，受到促进血管生成因子和抑制血管生成因子的共同调控。4ppt课件AS斑块内的新生血管主要来自外膜血管滋养管（vasavasorum）。通过新生血管，血液中的血浆脂蛋白和大量炎细胞流入斑块内，加重炎症反应。新生血管本身无平滑肌和周细胞支持，管壁薄弱，易于引起斑块内出血、斑块破裂甚至一系列临床严重并发症的发生。5ppt课件实验目的6ppt课件

研究炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,

GM-CSF）对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的作用。探讨GM-CSF和VEGF与AS斑块稳定性及病变进展之间的关系。7ppt课件实验方法8ppt课件原代培养HUVECs

应用Matrigel建立稳定的血管形成的体外培养体系。

9ppt课件

Matrigel的用法：

Matrigel冻存于-20℃，使用前置于4℃

过夜，融化成黄色胶状液体。

根据本实验研究所得的经验：用预冷的微量进样器在短时间内迅速加入预冷的24孔板中，每孔80μl/cm2（厚度约为0.5mm）。轻轻摇晃培养板，使其铺平。最后将培养板放入37℃孵育箱内，30分钟后即可使用。10ppt课件

HUVECs原代培养:

采用本实验室改进的Jaffe氏培养法。取健康新生儿脐带（最好不超过12h），PBS冲洗干净，0.25%胰酶消化（37℃，5分钟），用含5%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，收集消化液。离心（1000转/分钟，10分钟）。弃上清，用含20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，以5.0×105/cm2接种于涂有Matrigel的培养板内进行培养,24小时后换液。11ppt课件实验分组

GM-CSF作用的检测本实验根据不同的实验因素浓度和不同的作用时间，分别设计成浓度效应组和时间效应组。

12ppt课件

浓度效应组：正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF不同浓度组（25、50、100ng/ml），分别作用48h。时间效应组：取相同浓度rhGM-CSF（100ng/ml）不同作用时间组（12、24、48h）。13ppt课件

VEGF作用的检测正常对照组（无血清DMEM培养液）、rhGM-CSF（100ng/ml）组、rhGM-CSF（100ng/ml）+

VEGF165（10ng/ml）组，分别作用24h。14ppt课件相差显微镜下观察各实验组血管腔形成情况。各实验组用95%冰乙醇固定，4℃过夜。用CD34免疫细胞化学方法（SP法）显示各组血管形态。15ppt课件计数管腔数并进行统计学分析

每个实验组在40倍镜下选取3处血管密集的视野，100倍镜下计数每个视野的管腔数。应用SPSS、microsoftexcel进行统计分析和处理。P<0.05为有统计学意义。16ppt课件实验结果17ppt课件Matrigel对体外培养人脐带静脉内皮细胞形成血管的诱导作用

本研究提示，应用Matrigel可在体外诱导培养的人脐带静脉内皮细胞形成管腔结构。内皮细胞在培养后18小时开始形成管腔结构，24小时即可建立稳定的血管形成的体外模型。18ppt课件

图1在普通明胶上培养的人脐带静脉内皮细胞24小时形态，内皮细胞呈短梭形或多角形，达到亚融合（倒置相差显微镜x100）

19ppt课件图2Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小所建立的血管形成的体外模型（倒置相差显微镜x100）20ppt课件图3Matrigel诱导培养的人脐带静脉内皮细胞在24小时所建立的血管形成的体外模型（CD34免疫细胞化学染色x100）21ppt课件

本研究提示，与在普通明胶上生长的内皮细胞相比，在Matrigel上生长的内皮细胞生长周期较短，并且细胞不发生融合，而是形成相互连接的毛细血管样的血管网络。细胞间界限不清。22ppt课件不同浓度GM-CSF作用的检测23ppt课件图4正常对照组作用48小时形成的管腔数较少（倒置相差显微镜x100）

24ppt课件图5rhGM-CSF（25ng/ml）作用48小时形成的管腔数有所增多（倒置相差显微镜x100）25ppt课件图6

rhGM-CSF（50ng/ml）作用48小时形成的管腔数进一步增多（倒置相差显微镜x100）26ppt课件

图7rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小时形成明显的管腔结构，连接成血管网络（倒置相差显微镜x100）27ppt课件

图8

不同浓度rhGM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响（各组间P值均小于0.001）28ppt课件相同浓度GM-CSF不同作用时间的检测29ppt课件图9

rhGM-CSF（100ng/ml）作用12小时形成的管腔数较少（CD34免疫细胞化学染色x100）30ppt课件图10

rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小时形成的管数有所增多（CD34免疫细胞化学染色x100）31ppt课件

图11rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小时形成明显的管腔结构，连接成血管网络（CD34免疫细胞化学染色x100）32ppt课件图12相同浓度rhGM-CSF作用不同时间对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响（各组间P值均小于0.001）33ppt课件VEGF作用的检测34ppt课件图13正常对照组作用24小时形成的管腔数较少（CD34免疫细胞化学染色x100）35ppt课件图14rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小时形成的管腔数有所增多（CD34免疫细胞化学染色x100）36ppt课件

图15rhGM-CSF（100ng/ml）与VEGF165（10ng/ml）共同作用24小时形成明显的管腔结构，连接成血管网络（CD34免疫细胞化学染色x100）37ppt课件图16VEGF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响（各组间P值均小于0.001）38ppt课件讨论39ppt课件AS的炎症机制和斑块的不稳定性

炎症学说认为，AS是一种特殊的慢性炎症性疾病，表现为一系列高度特异的分子细胞反应，每一种特异性病变都表现为动脉炎症过程的不同阶段。在病变的发生发展过程中，脂蛋白、细胞成分（单核巨噬细胞、T淋巴细胞、ECs、SMCs）及ECM、炎性因子、细胞因子、生长因子相互作用。如果这个过程不减弱或过度发展，将导致晚期更为复杂的病变。40ppt课件

不稳定AS斑块的病变特征：①偏心的管腔周缘；②含有厚度易变或较薄的纤维帽；③脂质丰富；④局部巨噬细胞、T淋巴细胞等炎细胞浸润、活化；⑤新生微血管增多等。41ppt课件血管新生的过程及其调节

血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的生物学过程。

一般来讲，血管新生见于胚胎发育晚期及个体出生后。血管新生亦可见于许多病理情况，如缺血、创伤修复、AS、肿瘤、糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎等。

42ppt课件VEGF也称血管通透因子（vascular

permeabilityfactor，VPF）。

VEGF家族包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盘生长因子。

VEGF-A由于其mRNA剪切的不同可产生9种不同的蛋白异构体，其中最为常见的是VEGF121和VEGF165。43ppt课件VEGF由内皮细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞产生后，与仅存于内皮细胞膜上的两种酪氨酸蛋白激酶受体Flt-1、Flk-1/KDR特异性结合。通过自分泌或旁分泌途径介导内皮细胞迁移、增殖，进而诱导血管新生。44ppt课件AS斑块内血管新生及其调节

斑块内的新生血管大多位于内弹力膜附近，周围有大量炎细胞，常有含铁血黄素沉积或伴新鲜出血，说明在病灶局部出血、吸收经常发生。随着病变的发展，新生血管的检出率也逐渐增加，尤其在不稳定斑块更为明显。新生血管的数目、大小、形状也随之变化。45ppt课件

斑块内的新生血管与大血管的管腔相通，可作为更多的血浆脂蛋白进入斑块的通道而促进斑块生长。血液中的巨噬细胞、淋巴细胞等炎细胞通过新生血管流入到斑块内，释放多种炎性因子刺激血管生长因子的表达；另一方面，炎细胞也可以直接表达血管生长因子并释放多种蛋白水解酶如MMPs、胶原酶（Collagenases）、uPA等，促进了斑块内血管新生。而新生血管又为炎细胞在斑块内聚集提供了重要通道，从而形成恶性循环。46ppt课件

新生血管促进病变发展导致斑块破裂的机制：

新生血管无平滑肌及周细胞支持，无感受血流和血压的受体，管壁薄弱，易于引起斑块内出血、血栓及溃疡形成。新生血管内皮细胞高表达黏附分子，促进炎细胞聚集于斑块内，后者表达生长因子并分泌蛋白水解酶，降解纤维帽。47ppt课件

在AS斑块内，VEGF的阳性细胞数与内膜血管新生程度呈正相关，分布也高度一致，即主要位于斑块肩部及纤维帽。

VEGF可能直接促进内皮细胞生长，也可能促进骨髓中内皮前体细胞（endothelialprecursorcells，EPCs）的释放，后者迁移至AS斑块处参与血管新生。

本实验结果表明，加入外源性VEGF后，培养体系的血管形成显著增多。48ppt课件炎性因子对血管新生的影响及其作用机制

GM-CSF作为一种炎性因子，可由斑块处的巨噬细胞和SMCs、ECs分泌。GM-CSF具有促进骨髓细胞分化，调节白细胞功能的作用。但目前关于GM-CSF与血管新生之间关系的研究报道甚少。

本实验结果表明，随着GM-CSF浓度的逐渐增加和作用时间的延长，培养体系的血管形成随之增多。49ppt课件

本实验的成功之处在于，在体外培养HUVECs，应用Matrigel建立稳定的血管形成的体外培养体系，来观察GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响。目前在国内未见报道。50ppt课件

Matrigel在-20℃中至少可保存3个月，呈淡黄色。在2-8℃过夜后液化，在22-37℃迅速聚合成具有生物活性的玫瑰红色胶状物质。在37℃条件下可保存12天。

Matrigel在未稀释的情况下可涂成薄层（0.5mm）或厚层（1.0mm）,用无血清的培养液稀释（1:3）可涂成薄层（0.5mm）作为培养底物。尤其要注意的是，在使用过程中避免反复冻融。51ppt课件

Matrigel应用于生命科学和药物发现的研究已有15年。

Matrigel为细胞的迁移、侵袭、管腔结构的形成及细胞的生化功能、基因表达的研究提供了相关的环境。52ppt课件

目前认为，GM-CSF促进血管新生可能是由于细胞内JAK2/STAT3途径激活。在今后的研究中，有待于对这一机制作