蛋白质化学专题知识宣讲培训课件

蛋白质化学专题知识宣讲蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定的构象并具有一定生物功能的大分子。2蛋白质化学专题知识宣讲一、蛋白质的生物学意义1.生物体的组成成分2.酶3.运输4.运动5.抗体6.干扰素7.遗传信息的控制8.细胞膜的通透性9.高等动物的记忆、识别机构3蛋白质化学专题知识宣讲二、蛋白质的元素组成C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…N的含量平均为16%——凯氏（Kjadehl）定氮法的理论基础4蛋白质化学专题知识宣讲三、蛋白质的氨基酸组成氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸（20standardaminoacids)组成。（一）氨基酸的结构通式：19种氨基酸具有一级氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）结合到α碳原子（Cα），同时结合到（Cα）上的是H原子和各种侧链（R）；Pro具有二级氨基（α-亚氨基酸）5蛋白质化学专题知识宣讲不带电形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R两性离子形式Cα如是不对称C（除Gly），则：具有两种立体异构体[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]6蛋白质化学专题知识宣讲（二）氨基酸的分类根据R的化学结构（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；2）极性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）杂环氨基酸：Trp、His（4）杂环亚氨基酸：Pro根据R的极性（1）极性氨基酸：1）不带电：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）带正电：His、Lys、Arg；3）带负电：Asp、Glu（2）非极性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp7蛋白质化学专题知识宣讲（三）氨基酸的重要理化性质一般物理性质无色晶体，熔点极高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差别较大（极性和非极性），不溶于有机溶剂。两性解离和等电点氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在，在同一个氨基酸分子上带有能放出质子的—NH3+正离子和能接受质子的—COO-负离子，为两性电解质。3.化学性质（1）与茚三酮的反应：Pro产生黄色物质，其它为蓝紫色。在570nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定（几μg）。8蛋白质化学专题知识宣讲调节氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解离程度完全相等时，即所带净电荷为零，此时氨基酸所处溶液的pH值称为该氨基酸的等电点（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶体状态或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在碱性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（当氨基酸相互连接成蛋白质时，只有其侧链基团和末端的α-氨基，α-羧基是可以离子化的。9蛋白质化学专题知识宣讲氨基酸等电点的确定：1）酸碱滴定（滴定曲线）2）根据pK值（该基团在此pH一半解离）计算：等电点等于两性离子两侧pK值的算术平均数。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK3210蛋白质化学专题知识宣讲（2）与甲醛的反应：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)211蛋白质化学专题知识宣讲（3）与2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸12蛋白质化学专题知识宣讲H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高13蛋白质化学专题知识宣讲（4）与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF重复测定多肽链N端氨基酸排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”14蛋白质化学专题知识宣讲（5）与荧光胺反应：根据荧光强度测定氨基酸含量（ng级）。激发波长λx=390nm，发射波长λm=475nm。（6）与5,5′-双硫基-双（2-硝基苯甲酸）反应：15蛋白质化学专题知识宣讲H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸测定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩尔消光系数ε=13600）16蛋白质化学专题知识宣讲四、肽——一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物。氨基酸之间脱水后形成的键称肽键（酰胺键）。当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（25个氨基酸残基以下）和多肽（多于25个氨基酸残基）。多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基。肽链写法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。H2N-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）17蛋白质化学专题知识宣讲（一）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG（二）催产素和升压素均为9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。升压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。18蛋白质化学专题知识宣讲（三）促肾上腺皮质激素（ACTH）39肽，活性部位为第4~10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（四）脑肽脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。19蛋白质化学专题知识宣讲（五）胆囊收缩素（六）胰高血糖素由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽。胰高血糖素调节维持血糖浓度。20蛋白质化学专题知识宣讲五、蛋白质的结构蛋白质是氨基酸以肽键相互连接的线性序列。在蛋白质中，多肽链折叠形成特殊的形状（构象）（conformation）。在结构中，这种构象是原子的三维排列，由氨基酸序列决定。蛋白质有四种结构层次：一级结构（primary），二级结构（secondary），三级结构（tertiary）和四级结构（quaternary）（不总是有）。（一）蛋白质的一级结构（化学结构）一级结构就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序，即氨基酸的线性序列。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的。一级结构中包含的共价键（covalentbonds）主要指肽键（peptidebond）和二硫键（disulfidebond）21蛋白质化学专题知识宣讲HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB链15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A链711621SSSS牛胰岛素的化学结构—S————S——22蛋白质化学专题知识宣讲一级结构确定的原则：将大化小，逐段分析，制成两套肽片段，找出重叠位点，排出肽的前后位置，最后确定蛋白质的完整序列。目前往往采用从待测蛋白质的基因序列反推出蛋白质的一级结构。（二）蛋白质的空间结构（构象、高级结构）——蛋白质分子中所有原子在三维空间的排列分布和肽链的走向。23蛋白质化学专题知识宣讲由于羰基碳-氧双键的靠拢，允许存在共振结构（resonancestructure），碳与氮之间的肽键有部分双键性质，由CO-NH构成的肽单元呈现相对的刚性和平面化，肽键中的4个原子和它相邻的两个α-碳原子多处于同一个平面上。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα氨基的H与羰基的O几乎总是呈反式（trans）而不是顺式（cis）。蛋白质构象稳定的原因：1）酰胺平面；2）R的影响。24蛋白质化学专题知识宣讲1.蛋白质的二级结构——指蛋白质多肽链本身的折叠和盘绕方式（1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。结构要点：1）螺旋的每圈有3.6个氨基酸，螺旋间距离为0.54nm，每个残基沿轴旋转100°。2）每个肽键的羰基氧与远在第四个氨基酸氨基上的氢形成氢键（hydrogenbond），氢键的走向平行于螺旋轴，所有肽键都能参与链内氢键的形成。—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613(ns)25蛋白质化学专题知识宣讲3)R侧链基团伸向螺旋的外侧。RRRRRRRRR螺旋的横截面4）Pro的N上缺少H，不能形成氢键，经常出现在α-螺旋的端头，它改变多肽链的方向并终止螺旋。26蛋白质化学专题知识宣讲（2）β-折叠结构（β-pleatedsheet）是一种肽链相当伸展的结构。肽链按层排列，依靠相邻肽链上的羰基和氨基形成的氢键维持结构的稳定性。肽键的平面性使多肽折叠成片，氨基酸侧链伸展在折叠片的上面和下面。CαCαCαCαCαCαRRRRRRNNCNNCCC平行反平行β-折叠片中，相邻多肽链平行或反平行（较稳定）。27蛋白质化学专题知识宣讲（3）β-转角（β-turn）为了紧紧折叠成紧密的球蛋白，多肽链常常反转方向，成发夹形状。一个氨基酸的羰基氧以氢键结合到相距的第四个氨基酸的氨基氢上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-转角经常出现在连接反平行β-折叠片的端头。28蛋白质化学专题知识宣讲（4）自由回转没有一定规律的松散肽链结构。酶的活性部位。2.超二级结构和结构域超二级结构是指若干相邻的二级结构中的构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级结构至三级结构层次的一种过渡态构象层次。结构域是球状蛋白质的折叠单位。多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。29蛋白质化学专题知识宣讲3.蛋白质的三级结构——指多肽链上的所有原子（包括主链和侧链）在三维空间的分布。肌红蛋白4.蛋白质的四级结构——多肽亚基（subunit）的空间排布和相互作用。亚基间以非共价键连接。血红蛋白30蛋白质化学专题知识宣讲共价键次级键化学键肽键一级结构氢键二硫键二、三、四级结构疏水键盐键范德华力三、四级结构（三）蛋白质分子中的共价键与次级键31蛋白质化学专题知识宣讲肌红蛋白是1957年由JohnKendrew用X射线晶体分析法测定的有三维结构的第一个蛋白质。它是典型的球形蛋白质，高度折叠成紧密结构，疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部，极性残基在表面。肌红蛋白中有8条α-螺旋。由多肽的折叠形成的疏水空隙内是血红素辅基，通过肽链上的His残基与肌红蛋白分子内部相连，它对肌红蛋白的生物活性是必需的（与O2结合）。32蛋白质化学专题知识宣讲六、蛋白质分子结构与功能的关系蛋白质分子具有多样的生物学功能，需要一定的化学结构，还需要一定的空间构象。（一）蛋白质一级结构与功能的关系1.种属差异蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以断定它们在亲缘关系上的远近。2.分子病——蛋白质分子一级结构的氨基酸排列顺序与正常有所不同的遗传病。33蛋白质化学专题知识宣讲镰状细胞贫血（sick-cellanemia）从患者红细胞中鉴定出特异的镰刀型或月牙型细胞。β-链1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑点含氧HbS脱氧HbS疏水位点血红蛋白分子凝集34蛋白质化学专题知识宣讲（二）蛋白质构象与功能的关系别（变）构作用：含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质和功能发生改变的作用。因别构而产生的效应称别构效应。血红蛋白是别构蛋白，O2结合到一个亚基上以后，影响与其它亚基的相互作用。肌红蛋白血红蛋白在肺部O2的压力在毛细血管中O2的压力饱和度00.5120406080100120O2压力35蛋白质化学专题知识宣讲24681012140.51.01.52.0OH-加入的当量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly的滴定曲线OH-OH-+H3N—C—COOHHH（1）+H3N—C—COO-HH（2）H2N—C—COO-HH（3）Gly解离作用36蛋白质化学专题知识宣讲七、蛋白质的性质（一）蛋白质的相对分子量蛋白质相对分子量在10000~1000000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25~50*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）37蛋白质化学专题知识宣讲（二）蛋白质的两性电离及等电点蛋白质在其等电点偏酸溶液中带正电荷，在偏碱溶液中带负电荷，在等电点pH时为两性离子。电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。1.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。39蛋白质化学专题知识宣讲（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。+—2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。-+40蛋白质化学专题知识宣讲等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。++－－－－+－－－－－5.06.07.0稳定pH梯度5.06.07.0稳定pH梯度通电++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－41蛋白质化学专题知识宣讲（三）蛋白质的胶体性质布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）；2）带相同电荷。++++++42蛋白质化学专题知识宣讲（四）蛋白质的沉淀反应1.加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂3.加重金属盐4.加生物碱试剂单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。43蛋白质化学专题知识宣讲（五）蛋白质的变性天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性。变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。44蛋白质化学专题知识宣讲反应名称试剂颜色反应有关基团有此反应的蛋白质或氨基酸双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色

Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色

Trp坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸

（六）蛋白质的颜色反应—OHN45蛋白质化学专题知识宣讲六、蛋白质的分类1.蛋白质形状球状蛋白纤维状蛋白46蛋白质化学专题知识宣讲2.分子组成简单蛋白（按溶解度）结合蛋白（按辅基）清蛋白球蛋白谷蛋白醇溶蛋白精蛋白