转录组+代谢组专题（四） 中药活性物质研究及文章分享

转录组+代谢组专题（四）|中药活性物质研究及文章分享一、背景概述中药的研究一直离不开其核心的有效成分，虽然中药已经存在近6000年，但是对于有效成分的合成通路了解依旧甚少，而有效成分合成通路的研究对于提高植物体内有效成分的含量以及体外建立基因工程通路具有重大意义，例如2015年利用转录组+代谢组技术完善桃儿七中鬼臼毒素的合成通路为体外建立完善的鬼臼毒素合成通路建立了夯实的基础，因此利用现代研究技术助力药用植物合成通路研究，成为科学家们关注的重点。中国女药学家屠呦呦发现青蒿素获2015年诺贝尔生理学或医学奖二、中药活性物质中药活性物质是中药药材中产生的对人有特殊活性的代谢产物，其在不同的物种、组织、生长发育时期存在差异，大多数的活性物质都是次生代谢产物，包括生物碱、黄酮、萜类、香豆素、木脂素等物质类型，这类物质是植物非生长所必须的小分子有机化合物，其主要是由于植物生长适应外界复杂环境产生，对这些代谢产物的鉴定是中药活性成分合成通路研究的基础。表1不同中药物种中活性物质类型及功能三、中药活性物质合成相关基因和通路1.中药活性物质合成相关基因2.中药活性物质合成相关通路●喜树碱合成通路●●萜类代谢物合成通路●●鬼臼毒素合成通路●四、经典文献解读葛根中葛根素合成通路中的碳糖基化黄酮的分子机制期刊：TheplantJournal影响因子：IF=6.14发表时间：2017.01（一）研究背景类黄酮是一类通常以O-或C-糖苷形式存在的植物次级代谢产物。类黄酮-C-糖苷展现出多种生理功能，包括抗UV，防御病原体，抑制害虫生长和植物花色素的形成。它们也具有潜在的健康益处，如抑制癌症发展，预防低血压和肥胖。C-糖基转移酶（C-glycosyltransferases，CGTs）是负责黄酮类化合物和异黄酮类C-糖苷合成的重要酶。类黄酮CGT已经在几种植物中识别到。但是目前为止，还没有任何植物物种报道过编码异黄酮CGT的基因。异黄酮C-糖苷的一个重要物质是葛根素，是葛根中的主要药用活性物质。关于在葛根素生物合成期间发生的C-葡糖基化的知识仍然不足。（二）技术路线（三）研究结果1.葛根中UGT候选基因的分析基于葛根素主要在葛根的根部积累，所以选择UGT候选基因的前提是在根部表达。对葛根叶片及根进行转录组测序，已获得全部的UGT候选基因。转录组数据分析发现，有22条假定的全长PIUGTs基因在葛根中显著表达。对22条候选基因做系统发育树分析这些UGT基因的相关性。22条基因根据生化活性被分为7类，其中只有PIUGT43在植物类黄酮C-糖基化类（簇6）（图1）。并且，在22个假定PIUGTs基因中，只有PIUGT43在根中的表达水平与进入异黄酮骨架的关键基因2-HIS的表达水平相符，其余基因表达量都比较低。以上数据表明葛根素合成通路的最好候选基因为PIUGT43。PIUGT43基因与作者前期的文章中报道的GT03H24有83%的同源性。此外，系统发育树分析显示，GT03H24是与植物2-羟基黄烷酮CGTs进化枝中PlUGT43的亲缘关系更近的UGT（图1）。因此，作者决定研究GT03H24和PlUGT43在葛根素生物合成中的作用。图1PIUGT43与其他UGTs基因的系统发育树2.PIUGT43在葛根素合成通路中显示CGT活性为了验证PIUGT43和GT03H24的生化特性，将其用HIS标签进行纯化并在大肠杆菌中表达。在UDP-葡萄糖的存在下，首先用大豆黄素和2-羟基异黄烷酮（它们是葛根素生物合成最可能的底物）测试纯化的重组蛋白的活性。在不存在重组蛋白的情况下进行对照测定。通过加入甲醇停止反应。当使用大豆黄素作为底物时，在与PlUGT43的反应中产生对应于葛根素的产物（峰1），但在对照测定中不产生（图2a）。峰1的保留时间和MS/MS信号离子基本上与葛根素标准品相同（图2c，d）。与对照相比，以2-羟基异黄烷酮为底物时，产生极少量葛根素，有可能是2-羟基异黄烷酮自发脱水为大豆黄素的结果，因此说明，PlUGT43不能将2-羟基异黄烷酮转化。另外，以大豆黄素或2-羟基异黄烷酮为底物的情况下，GT03H24未显示出活性。因此，体外验证表明，PlUGT43具有控制葛根素生物合成的能力。图2重组PIUGT43催化大豆苷元和染料木黄酮的C-葡萄糖基转移酶反应3.PlUGT43对异黄酮显示严格的底物专一性使用UDP-葡萄糖作为蔗糖供体，测试PIUGT43在葛根素生物合成中的可能底物（图3a）。体外测定以及LC-MS分析发现，除了大豆黄素之外，PIUGT43仅对染料木黄酮有活性，并未检出对其他底物有活性。PIUGT43将染料木黄酮转化为峰2中的物质。峰2的MS1分析显示产物比染料木黄酮的分子量多162个Da，表明产物是染料木素单葡糖苷。峰2的MS/MS碎片梨子的信号为313和283，分别丢失了120和150Da（图2e和3f）。信号产物质荷比313缺失了120的情况下，是C-糖基化的特征，我们根据这个特征推断峰2的物质是C糖基化黄酮。在黄酮的C-糖苷中，先前已经报道了6-C-或8-C-糖苷共轭物，MS/MS分析是区分C6或C8糖苷的最佳技术之一。例如，当以正模式进行MS/MS分析时，通常仅在C8-异构体的碎裂中观察到[M+H-90]次要离子产物;相反，[M+H-4H2O]片段通常仅在C6-糖苷的碎裂中发现。PlUGT43与任何上述底物的反应中未检测到O-葡糖苷，表明PlUGT43不具有O-糖基化活性。因此，这些结果表明PlUGT43对类异黄酮具有严格的底物特异性。相反，GT03H24在本研究中没有显示任何测试的底物的活性。图3PlUGT43对异黄酮显示出底物特异性4PlUGT43的过度表达导致大豆中产生葛根素大豆中可以产生异黄酮通路上游的核心代谢产物大豆黄素，但是未表现出异黄酮碳糖基化的活性，并且文章中也未报道过大豆中有碳糖基化黄酮。在大豆中过表达PlUGT43基因来检测PlUGT43在植物中的酶功能。图4所示，LC-MS仅在转化PlUGT43的大豆根部检测到正离子模式下有一个417的母离子的峰（峰1），峰1与葛根素的二级谱信息一致，表明转入PlUGT43基因后，大豆中可以产生碳糖基化黄酮。图4葛根中的UDP糖基转移酶（PIUGT43）表现出对异黄酮的偏好性（四）研究结果葛根素是葛根中特有的代谢产物，在豆类物种中都不产生，本文通过转录组分析，找到控制葛根素合成的候选基因，并利用代谢组的检测方法去验证基因的功能，从而发现了控制葛根素合成的关键基因，并且将基因转入大豆中，实现了体外葛根素的合成。参考文献：WangXin,LiChangfu,ZhouChene