生物竞赛课程16讲技术一

敲除（Geneknockout）：是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗 令特定 功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出 的生物学功能 敲低/敲减/敲降/敲落（Geneknockdown）：通过降解具有同源序列靶 DNA本身的变化，基本是不可遗传的。 敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶 敲掉一 并不一定就能获知 的功能，其原因例如 对于某些必 ，敲除后会造成细胞的致死性，也就无法对这些必 进行相应的研究了2 技术，又 技术世界上第一个测定DNA序列的方法是由英国生化学家弗雷德里克·桑格尔发明的。自此DNA的速度就一直呈加速态势。2001年人类组草图耗资4.37亿，耗时13年。到了2007年，第一个完整人类组序列图谱的诞生只花费了150万，3个月就完成了。 一 原理 －双脱氧末端终止法1977年，英国人FredSanger发现，如果在DNA过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的 化学奖 组时代最理想 方法进入21世纪后，以Roche454、IlluminaSolexa和ABISOLiD为代表的第二代 技术（next-generationsequencing,NGS）是对传统Sanger法 个物种的转录组 组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深 (deepsequencing)。二 技术对于未知样本、混合样本 组较大的物种 应用具有优势一 技术仍为金标准 技术 锚定在零模波导孔(zero-modewaveguides,ZMWs)底部；4种不同荧光标记的dNTP随机进入ZMW底部； 动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长 读长。平均读长8-12Kb，长可达40-70Kb 错误的偏向，因而可以通过多 来进行有效的纠错 技术-纳米 （nanopore科技为蛋白纳米孔。放在背包里 仪无数个纳米孔被集成在一张石墨烯做成 上，每 上有512组纳米孔，可以同时 序 可处理长度在10,000-50,000bp的DN 段，未来甚至达到100,000bp。这些长 流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测 将待测样品（如细胞、、或细菌等）经荧光染前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射细胞时，侧向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 压电晶 产生机械振 44Yeast-two-hybrid:利用酵母细胞研究两种蛋白质相互作用 通常情况下，一个正常转录因子蛋白必须同时包含了DNA-BD和AD这两个结构域，才能够顺利启动表达。但科下游的表达。找到与目标蛋白结合的其他感的蛋白。

仅有DNA-BD仅有AD同时具有BD和AD，启 表proteinproteinproteinproteinproteinproteinproteinproteinA和

A和 (C)A和 (D)B和55带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。利用带电粒子在电聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应仅根据蛋白质亚基分子量的不同SDS一般采用的是不连续缓冲系统不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶蛋白质的等电点（isoelectricpoint，pI），蛋白质溶液处于某一pH溶液时，蛋白质解离成正、负离子双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合，即先进行等电布的蛋白质图。蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作 谱，尤其是对已经物种图谱建立，可以更好的研究的功能，表达后的修饰等方面的研究提供有力 毛细管电泳（capillaryelectrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（highperformancecapillary毛细管等电聚焦聚丙烯酰胺毛细管凝胶电泳微量：进样所需的样品体积为nL

自动：CE凝胶电泳是分子生物学中鉴定、量化和纯化核酸的常用实验技术。因其速度、简便性和通用性，该方法广泛应用于核酸的分离和分析。可以分辨用其它方法（如密度 段。采用凝胶电泳法，可在几分钟到数小时内分离出约0.1-25kbp范围内的核酸，且可高纯、高效地从凝胶中回收分离的核酸。1选择 2345 分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DN 聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于1kb的核酸分子；50–50,0005-3,000510糖便会融化，变成无规卷曲。冷 胺。TEMED和过硫酸铵(APS)催化

图1图2丙烯酰胺在APS和TEMED 标准品俗称DNAladder，含有已知大样品移动至正电极侧(图2A)。该方图14＆5 像系统显影。激发光源可以在凝胶

图2图3 组编辑（Genomeediting）是指对受体细胞变，从而实现对组的特异改造。该方法是深入了解疾病发病机制、探索功能乃至医学治疗的重要之一。（molecularscissors）。这些核酸酶在 breaks,DSBs)，这些断裂的双链位点通过同源重组(homologous 组(nonhomologousend-joining,NHEJ)进行修到目前为止，共有四个的工程核酸酶被广泛meganucleases（巨核酸酶）zincfingernucleases(锌指核酸酶，ZFNs), 科学家们不断寻求更加精准、便捷的方法对特定的组位点进行高效敲入或者靶向修饰。人工核酸酶介导的组编辑技术应运而生，相比较早期方法，工程核酸酶改造难度和成本都降低，已在基础研究、治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜早期的技术被称 ZFNTALENDNA结合蛋白为基础，对每一个位点的编辑都需要经过重新设计、合成并组装具有特异性DNA识别能力蛋白模块，步骤繁琐，载体构建复杂，周期长，难于用来开展大规模编辑的筛选，限制了其应用前景；2012—2013年，科学家发现了 编辑的另一个突破性技术CRISPR/Cas系统，使基因编辑技术进一步简化。该技术遵循RNA与DNA之间的碱基互补配对原则，利用RNA介导的核酸酶与靶DNA序列结合，从而达到 CRISPR/Cas系统具有良好的靶向性、构建简单、可同时操作多个 等优点。该技 CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic 原核生物在抵御过程中建立图.细 原间隔（protospacers 修复，成功将外源DNA整合到细菌组中，完成 遇到二次时，细菌基二次的DNA；

含有原间隔的细 组长的前体 序列、cas子（Cas9的编码（repeatandspacer） tracrRNA、Cas9RNA和pre-Cas9RNA被进一步翻译成蛋白质，物；然后通过RNAseIII酶的裂解释DNA (homologydirectedrepair,HDR)或非同源重组(non-homologousendjoining,NHEJ)，这是细胞的一种自身 任何一种组编辑技术都依赖于DNA双链断裂(DSB)的修复机制；组编辑的关键是在组内的特定位 组间隔区(spacer)发现，这些被切除的spacer来，可以创建一个向导RNA(ashortnoncodingguideR