生物制药工艺技术基础

生物制药工艺技术基础第1页，课件共41页，创作于2023年2月（二）血液、分泌物和其它代谢物血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等。 尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料。由尿液可制备尿激酶，HCG。第2页，课件共41页，创作于2023年2月（三）海洋生物（1）海藻抗肿瘤、防止心血管疾病、治疗慢性气管炎（2）腔肠动物海葵毒素（3）节肢动物甲壳素（4)软体动物多糖、多肽、毒素（5）棘皮动物海星、海胆、海参海参素抗癌（6）鱼类鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7）爬行动物海蛇提取物对中枢神经、呼吸系统和 运动系统有明显活性作用。（8）海洋哺乳动物鲸鱼鱼肝油（四）植物天花粉蛋白、相思豆蛋白、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、无花果蛋白酶、苦瓜胰岛素、香菇多糖、人参多糖、茶叶多糖。第3页，课件共41页，创作于2023年2月（五）微生物1.细菌主要发展领域有：（1）氨基酸（2）有机酸（3）糖类（4）核苷酸类：5‘-肌苷酸（5）维生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶：淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶第4页，课件共41页，创作于2023年2月2.放线菌

放线菌是最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约2/3产自放线菌。（1）氨基酸（2）核苷酸5‘-脱氧肌苷酸（3）维生素（4)）酶3.真菌（1）

酶（2）有机酸（3）氨基酸（4）核酸及有关物质（5）维生素（6）促生素（7）多糖第5页，课件共41页，创作于2023年2月4.酵母菌（1）维生素（2）蛋白质与多肽（3）核酸（六）开发生物新资源（1）动植物细胞的大规模培养（2）应用基因工程技术建立工程菌或工程细胞第6页，课件共41页，创作于2023年2月四、生物材料的准备

生物材料的制造主要包括以下工艺过程：1)生物材料的选取与预处理；2)从生物材料中提取有效活性物质；3)有效成分的分离，纯化4)后处理及制剂第7页，课件共41页，创作于2023年2月（一）生物材料的选取1.有效成分的含量（1）生物品种根据目的物的分布，选择富含有效成分的生物品种是选材的关键。（催乳素，哺乳动物）（2）合适的组织器官（胃蛋白酶，胃）（3）生物的生长期生物的生长期对生理活性物质含量影响很大。2.杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响收率、质量和经济效益。3.来源应选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料，最好能一物多用，综合利用。

胰脏制备弹性蛋白酶和激肽释放酶，胰岛素与胰酶等。第8页，课件共41页，创作于2023年2月（二）生物材料的采集与保存 生理活性物质易失活与降解，采集时必须保持材料的新鲜。防止腐败、变质与微生物污染。生物材料采摘选取后，必须快速及时速冻，低温保存，防止生物活性成分的变性、失活，酶原提取要及时进行。如胰脏采摘后要立即速冻，防止胰岛素活力下降。保存生物材料的主要方法有：（1）冷冻法（2）有机溶剂脱水（3）防腐剂保鲜法

第9页，课件共41页，创作于2023年2月生物活性物质常用的提取方法（一）用酸、碱、盐水溶液提取 用酸、碱、盐水溶液可以提取水溶性、盐溶性的生化物质。（二）表面活性剂提取表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团，分布于油水界面时，有分散、乳化和增溶作用。表面活性剂分阴离子型、阳离子型与非离子型。离子型表面活性剂作用强，但是易引起蛋白质等生物大分子的变性，非离子表面活性剂变性作用小，适合于用水、盐系统无法提取的提取的蛋白质或酶的提取。第10页，课件共41页，创作于2023年2月（三）有机溶剂提取1.固－液提取 常用于水不溶性的脂类、脂蛋白、膜蛋白结合酶等。如用丙酮从动物脑中提取胆固醇。有机溶剂在提取分离物质时，有单一溶剂分离法与多种溶剂组合分离法，如先用丙酮，再用乙醇，最后用乙醚提取，可以从脑中依次分离出胆固醇、卵磷脂和脑磷脂。

2.液－液萃取液－液萃取是利用溶质在两个互不混溶的溶剂中溶解度的差异，将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移的操作。影响液－液萃取的因素主要有目的物在两相的分配系数和有机溶剂的用量。

第11页，课件共41页，创作于2023年2月溶剂萃取的注意事项：（1）pH：在萃取操作中正确选择pH值很重要。因为在水溶液中某些酸、碱物质会解离，在萃取时改变了分配系数，直接影响提取效率。（2）盐析：加入中性盐如硫酸铵，氯化钠等可以使一些生化物质的溶解度减少，这种现象成为盐析。在提取液中加入中性盐，可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（3）温度：一般在室温下或低温下进行萃取操作。（4）乳化：在液液萃取时，常发生乳化作用，使有机溶剂与水相分层困难。去乳化的常用方法有：过滤与离心，轻轻搅动，改变两相的比例；加热，加电解质，加吸附剂。液-液萃取时溶剂的选择：（1）选用的溶剂必须具有较高的选择性，各种溶质在所选的溶剂之间分配系数差异愈大愈好。（2）选用的溶剂，在萃取后，溶质与溶剂要容易分离与回收。（3）两种溶剂的密度相差不大时容易形成乳化，不利于萃取液的分离。（4）要选用无毒，不易燃烧的价廉易的溶剂。第12页，课件共41页，创作于2023年2月二、生物活性物质提取方法的选择 提取是利用制备目的物的溶解特性，将目的物与细胞的固形物成分或其它结合成分分离，使其由固相转入液相或从细胞生理状态转入特定溶液环境的过程。 要取得好的提取效果，最重要的是要针对生物材料和目的物的性质选择合适的溶剂系统与提取条件。生物材料及其目的物与提取有关的一些性状包括溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、比重、粒度、粘度，目的物含量，主要杂质种类及溶解性质，有关酶的特征等。其中最主要的是目的物与主要杂质在溶解度方面的差异以及它们的稳定性。操作者可根据文献资料及本人的试验摸索获得的有关信息，在提取过程中增加目的物的溶出度，尽可能减少杂质的溶出度。第13页，课件共41页，创作于2023年2月（二）活性物质的保护措施（1）采用缓冲盐系统 在生物药物制备中，常用的缓冲盐有磷酸缓冲盐，柠檬酸缓冲盐，Tris缓冲液，醋酸缓冲盐，碳酸缓冲盐，硼酸缓冲盐和巴比妥缓冲盐等。（2）添加保护剂 防止某些生理活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏，如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团，极易被氧化，故提取时，常添加某些还原剂如半胱氨酸，－巯基乙醇。对易受重金属影响的，可添加EDTA。（3）抑制水解酶的作用（4）其它保护措施（冷、热、酸、碱）第14页，课件共41页，创作于2023年2月生物活性物质的浓缩与干燥一、生物活性物质的浓缩（一）盐析浓缩：硫酸铵沉淀蛋白质（二）有机溶剂沉淀浓缩：在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇，丙酮等有机溶剂，可以使生化物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来。（三）用葡聚糖凝胶（Sephadex）浓缩（四）用聚乙二醇透析浓缩（五）超滤浓缩（六）真空减压浓缩与薄膜浓缩真空减压浓缩在药物生产中使用较为普遍，具有生产规模较大，蒸发温度较低，蒸发速度较快等优点。薄膜浓缩器的加速蒸发的原理是增加汽化表面积。使液体形成薄膜而蒸发，成膜的液体具有较大的表面积，热传播快而均匀，没有液体静压的影响，能较好地防止物料的过热现象。第15页，课件共41页，创作于2023年2月第16页，课件共41页，创作于2023年2月生物活性物质的干燥：（1）减压干燥（2）喷雾干燥（3）冷冻干燥第17页，课件共41页，创作于2023年2月第18页，课件共41页，创作于2023年2月

第四节生化物质的分离纯化方法一、生物制药中分离制备方法的特点（1）生物材料组成非常复杂。一种生物材料常含成千上万成分，各种化合物的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同。没有固定操作方法。（2）有些化合物在生物材料中含量极微，只达万分之一，甚至百万分之一。因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。（3）生物活性物质离开生物体后，易变性，破坏，分离进程必须十分小心的保护这些化合物的生理活性。（难点）（4）生物制药的分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH，离子强度）对溶液中各种组分的综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强。（5）为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物制药中的分离方法多采用温和的逐级分离方法。亲和层析分离具有分离的专一性，高效性。（6）生物产品最后均一性的证明与化学纯度的概念不完全相同，因生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能关系比较复杂。第19页，课件共41页，创作于2023年2月生物大分子分离纯化的基本方法：（1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心、膜分离（透析，电渗析）与超滤，凝胶过滤法。（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。（3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，等电点沉淀法，及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附法与吸附层析法。（5）根据配体特异性进行分离—亲和层析法。第20页，课件共41页，创作于2023年2月三、分离纯化的基本程序和实验设计 生物体内某一组分，特别是未知结构的组分的分离制备设计大致上分为五个基本阶段。（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定法。（2）制备物理化性质稳定性的预备试验。（3）材料处理及抽提方法的选择。（4）分离纯化方法的摸索。（5）产物均一性测定。第21页，课件共41页，创作于2023年2月 提取是分离纯化目的物的第一步，所选的溶剂应对目的物具有最大的溶解度，并尽量减少杂质进入提取液。分离纯化是生化制备的核心操作。1.分离纯化早期使用方法的选择分离纯化的早期，由于提取液中的成分复杂，目的物浓度较稀，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化方法。早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩的作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高。第22页，课件共41页，创作于2023年2月2.各种分离纯化方法的使用程序生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要依据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。而每一种方法又都是在特定条件下发挥作用。因此，在相同或相似条件下连续使用同一种分离方法就不太适宜。在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率。对于一未知物通过各种方法的交叉应用，有助于进一步了解目的物的性质。3.分离后期的保护性措施 在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气氧化和某些事先无法了解的因素。第23页，课件共41页，创作于2023年2月四、分离纯化方法步骤优劣的综合评价 每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。对每一步骤方法的优劣，体现在所得产品重量与活性平衡关系上。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。五、制备物均一性的鉴定均一性是指所获得的制备物只有一种完全相同的成分（纯度鉴定）。生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法、化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法。第24页，课件共41页，创作于2023年2月一、微生物菌种的选育与菌种保藏1.菌种的分离(separationstrain)微生物种类繁多，易于培养，是工业化生产各种生物药物的主要材料。（1）含菌样品的收集根据微生物的生态特点，从自然界取样，分离所需要菌种，如到堆积和腐烂纤维素的地方去取样分离纤维素酶产生菌。到温泉附近取样分离高温蛋白酶产生菌。一般可以从土壤中分离所需微生物，取样时先将表土刮去2~3cm，在同一条件下选好2~5点土样混在一起包好，表明采样地点及日期备用。（2）富集培养收集到的样品若含所需要的菌较多，可直接分离。如含所需要的菌很少，就需要经过富集培养，使所需要的菌大量生长，以利于筛选。再配合控制温度，pH或营养成分即可达到目的。有时用能分解的底物作为生长和诱导产生所须成分的培养基成分，以使所需要的菌种得到快速生长，有利于进一步分离。（3）菌种纯化在自然条件下，各种类型的菌混杂在一起生活，所以要进行分离，以获得纯种。菌种纯化的方法一般采用稀释分离或划线分离法。微生物制药工艺技术基础第25页，课件共41页，创作于2023年2月2.菌种的筛选 筛选前，先要考虑哪些微生物是筛选的对象。如有报道，则根据文献收集可能性最大的的微生物进行筛选。如无报道，则可根据一般知识，以不同种属代表，先进行广泛比较，再进行自然选育或诱变育种以获得优良菌株。第26页，课件共41页，创作于2023年2月3.菌株的选育 从自然界直接分离得到的菌种，都不能立即适应实际生产需要。只有通过诱变，选育才能使产量成倍，成百倍地提高。选育方法基本上可以分成两类：随机选择突变体；根据代谢的调节机制选择各种突变体。（1）自然选育（2）诱变育种一般程序是采用诱变剂诱变处理微生物，增殖培养，经过稀释涂布，随机选择部分或全部单菌落，逐个测定它们的生物活性。最后挑选出产量或其它性能比亲代菌株优秀的突变株。（3）根据代谢的调节机理选择高产突变体根据代谢的调节机理选择高产突变体。(抗性基因)第27页，课件共41页，创作于2023年2月诱变育种：出发菌株的选择：（1）挑选纯系菌株（2）选用具备某种优良特性的菌株（3）挑选对诱变剂敏感的菌株（4）菌种的生理状态及生长发育时间诱变处理：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂（1）物理诱变：UV、X-ray等（2）化学诱变：烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂（3）生物诱变：噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种的选育第28页，课件共41页，创作于2023年2月现代菌种选育技术（1）杂交育种（2）原生质体融合（3）基因工程技术第29页，课件共41页，创作于2023年2月重组DAN技术示意图第30页，课件共41页，创作于2023年2月

4.菌种的保藏 （1）菌种的退化与防止生产菌种本来在自然环境下生长，所以在人工培养条件下，任何菌株通过一系列的转接传代都可能发生退化。一般把菌株的生活力，产孢子能力的衰退和特殊产物产量的下降，成为退化。菌种退化现象的鉴别：①单位容积中发酵液的活性物质含量；②琼脂平皿上的单菌落形态；③不同培养时期菌体细胞的形态和主要遗传特征。如形成孢子能力；④发酵过程pH变动情况；⑤发酵液的气味、色泽。

菌种退化防止措施：①防止基因突变，基因突变是菌种退化的一个主要原因，低温保藏法可以减少突变得产生。②采用双重缺陷型采用双营养缺陷标志可间接而有效地防止突变③制定科学管理制度制作平行菌种斜面；④分离单菌落；认真进行单菌落分离工作，再多做平行的菌种斜面；⑤选择培养条件选择有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件。第31页，课件共41页，创作于2023年2月（2）常用的菌种保藏方法斜面保存法：将菌种转接到新鲜的琼脂斜面上，待生长良好后，于4℃保存。根据具体情况，间隔一定时间后转接。冷冻干燥法：将菌种悬浮于脱脂消毒牛奶中，快速冷冻，真空干燥。液氮超低温保藏法：微生物在-130的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。甘油冷冻保存法：将对数期菌体悬浮于新鲜培养基中，加入15%消毒甘油，混匀速冻，冻存于－70~－80℃。第32页，课件共41页，创作于2023年2月二、微生物的培养（一）微生物生长的六大营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水。（二）微生物培养基（三）灭菌与除菌方法（四）微生物的培养方法第33页，课件共41页，创作于2023年2月重组DNA技术基本原理：

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。

获取目的基因的方法有：（1）建立cDNA文库，筛选目的基因（2）通过PCR技术制备目的基因（3）通过RT-PCR制备目的基因（4）人工合成目的基因第34页，课件共41页，创作于2023年2月cDNA文库构建示意图第35页，课件共41页，创作于2023年2月