植物组织培养

植物组织培养1第1页，课件共75页，创作于2023年2月2本讲主要内容：一、植物组织培养的理论基础二、植物组织培养操作技术第2页，课件共75页，创作于2023年2月知识点:基本概念：有性生殖、无性生殖、植物细胞全能性、细胞分化、脱分化、再分化、愈伤组织等；植物离体培养中再生植株有哪些途径？愈伤组织是如何形成与生长的？3第3页，课件共75页，创作于2023年2月一、植物组织培养的理论基础1、植物的无性繁殖：不经过精、卵细胞的结合，而是通过母体的部分组织或器官来进行繁殖的方式。4第4页，课件共75页，创作于2023年2月植物的全能性：1879年Hansen提出，即植物体的部分组织或器官具有发育成完整植株的潜在能力，称之为植物的全能性。2、植物细胞的全能性（Totipotency）植物细胞的全能性：1902年由Haberlandt提出，每一个植物细胞具有该植物的全部遗传信息，都有分化成一个完整植株的潜在能力。5第5页，课件共75页，创作于2023年2月外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等叶片茎段种子茎尖

6第6页，课件共75页，创作于2023年2月细胞全能性的相对性:细胞全能性并不意味着任何细胞均可以直接产生完整植株;动植细胞全能性的表现程度存在明显的差异.7第7页，课件共75页，创作于2023年2月一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。8植物细胞全能性表现根据细胞类型不同，其全能性表现从强到弱依次为第8页，课件共75页，创作于2023年2月根据细胞所处的组织不同从强到弱：顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织（基本组织）>厚角组织>辅导组织>厚壁组织9第9页，课件共75页，创作于2023年2月

植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。离体细胞具有生命的特征属性，在全能性的基础上，提供合适的营养和环境条件，离体细胞经历脱分化和再分化过程，可形成再生植株。10第10页，课件共75页，创作于2023年2月3、植物细胞物细胞全能性的实现途径细胞全能性脱分化个体再生再分化细胞分裂

细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化是细胞全能性表达的最终体现。11第11页，课件共75页，创作于2023年2月3.1植物细胞的再分化分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，体现在细胞分化、组织分化、器官分化三个水平上。12第12页，课件共75页，创作于2023年2月细胞分化：是指导致细胞形成不同结构或引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是离体培养再分化植株再生得以实现的基础。13第13页，课件共75页，创作于2023年2月脱分化（去分化）：是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂，逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织，或成为未分化细胞特性的过程。3.2植物细胞的脱分化愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。14第14页，课件共75页，创作于2023年2月15第15页，课件共75页，创作于2023年2月

脱分化诱导期间会导致细胞膜透性改变，细胞核增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃等。但目前对于脱分化的机理尚未完全阐明。脱分化的机理16第16页，课件共75页，创作于2023年2月

注意：

魔芋体细胞胚a并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞，进而形成体细胞胚；

b多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞，即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异。17第17页，课件共75页，创作于2023年2月（1）损伤：切割损伤的刺激，促使细胞增殖。（2）生长调节剂：离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实现的。种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例是影响根、芽等分化的关键。影响脱分化的主要因素18第18页，课件共75页，创作于2023年2月

一般情况下,高的生长素/细胞分裂素浓度比的情况下，有利于根的的形成，反之有利于芽的形成。而当生长素和细胞分裂素含量相当时，有利于愈伤组织的生长。19第19页，课件共75页，创作于2023年2月NAA（愈伤组织一定量）A：NAA0mg/L，芽（多），根（无）B：NAA0.1mg/L，芽（多），根（无）C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多）ABC20第20页，课件共75页，创作于2023年2月BA（愈伤组织一定量）A：BA(0mg/L)，芽（减少），根（增多）B：BA(0.1mg/L)，芽（增多），根（减少）AB21第21页，课件共75页，创作于2023年2月（3）光照：弱光或黑暗条件有利于脱分化中的细胞分裂（即愈伤组织的诱导）。（4）温度：愈伤组织诱导培养时，温度可以适当提高，而分化温度比诱导温度要低。（5）细胞位置：外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。22第22页，课件共75页，创作于2023年2月23第23页，课件共75页，创作于2023年2月（6）外植体的生理状态：不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。（7）植物种类的差异：一般双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。24第24页，课件共75页，创作于2023年2月3.3植物细胞的再分化

指是脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞、组织、器官的，甚至形成完整植株的过程。

25第25页，课件共75页，创作于2023年2月3.3植物的形态建成

愈伤组织的形成

在细胞脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的诱导形成是一个内、外环境因素相互作用的复杂过程，可分为诱导期、分裂期和分化期。

26第26页，课件共75页，创作于2023年2月诱导期（起动期）：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。分裂期：分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分化期：是指细胞内出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能上的细胞。如薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等。27第27页，课件共75页，创作于2023年2月黑暗条件下培养地烟草愈伤组织28第28页，课件共75页，创作于2023年2月愈伤组织的保持-转接随着愈伤组织的分化，如果在原培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期（如2~4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以保持长期旺盛的生长。29第29页，课件共75页，创作于2023年2月器官分化经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，形成不同的器官原基（如不定芽、不定根），进而发育成完整植株。

30第30页，课件共75页，创作于2023年2月愈伤组织的形态发生方式主要有器官发生和胚状体发生两条途径。器官发生是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。31第31页，课件共75页，创作于2023年2月

胚状体（体细胞胚）发生:是由愈伤组织形成类似种子的胚的结构，同时产生芽端和根端的结构，称为胚状体。32胚状体经历与合子胚相似的发育过程，从球形胚、心形胚、鱼雷胚到成熟胚。第32页，课件共75页，创作于2023年2月33第33页，课件共75页，创作于2023年2月

根据起源不同，器官发生分为两种类型：间接器官发生（器官发生型）：先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基，后形成不同器官。直接器官发生（器官型）：直接从外植体的细胞形成器官原基，然后发育成器官。34第34页，课件共75页，创作于2023年2月花直接诱导形成芽愈伤组织分化出不定芽35第35页，课件共75页，创作于2023年2月器官发生再生植株的方式：A.先形成芽，芽的基部再产生根；

B.先形成根，根上再出芽；

C.

愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束组织把两者结合起来.36第36页，课件共75页，创作于2023年2月二、植物组织培养的操作技术1.灭菌与消毒2.培养基的组分与配制3.培养材料的接种4.种质资源的离体保存37第37页，课件共75页，创作于2023年2月1.灭菌与消毒

植物材料消毒：常用的消毒剂

玻璃的器皿灭菌

接种工具的灭菌

实验服、口罩、滤纸灭菌

接种室灭菌

物体表面灭菌

培养室灭菌38第38页，课件共75页，创作于2023年2月药剂灭菌：不同材料，不同灭菌剂其使用浓度、时间与效果不同。干热：160-180℃,1.5-2.0h湿热：101.3kpa,121℃,20-40min接种前酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。喷雾、涂抹杀菌紫外灯照射（20-30min）臭氧灭菌机：1-2h熏蒸灭菌：5-8ml/m3甲醛+5g/m3

高锰酸钾；冰醋酸；1-3%高锰酸钾或3%来苏儿。常用灭菌的方法：39第39页，课件共75页，创作于2023年2月2.培养基的组分与配制(P173)

培养基种类

固体培养基

液体培养基营养分布均匀，生长整齐一致，但通气性差。通气性较好，便于操作，但营养分布不均，生长发育不整齐。40第40页，课件共75页，创作于2023年2月培养基成分水无机盐有机物植物激素支持材料辅助性物质41第41页，课件共75页，创作于2023年2月无机盐大量元素(≥0.5mmol/L)微量元素(≤0.5mmol/L)元素名称添加形式元素名称添加形式NKNO3,NH4NO3FeFeNa2-EDTAPKH2PO4,NaH2PO4BH3BO3KKCl,KNO3MnMnSO4CaCaCl2·2H2OCuCuSO4MgMg2SO4·7H2OMoNa2MoO4·2H2OSMg2SO4·

7H2OClCaCl2·2H2O42第42页，课件共75页，创作于2023年2月有机物碳水化合物蔗糖（葡萄糖、果糖）维生素天然复合物椰乳香蕉泥马铃薯水解酪蛋白其它肌醇（环已六醇）氨基酸43第43页，课件共75页，创作于2023年2月维生素硫胺素吡哆醇烟酸生物素泛酸钙叶酸浓度：0.1－1.0mg/L作用：参与酶的形成,参与植物蛋白质,脂肪的代谢等重要生命活动.44第44页，课件共75页，创作于2023年2月氨基酸甘氨酸丝氨酸酪氨酸谷氨酰胺天冬酰氨水解酪蛋白水解乳蛋白45第45页，课件共75页，创作于2023年2月生长素类种类：IAA、NAA、IBA、2,4－D作用：诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。浓度：0.05－5mg/L赤霉素类（GA）种类：有20多种，组培中用GA3作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。细胞分裂素类种类：6－BA、KT、ZT等。作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。浓度：0.05－100mg/L脱落酸（ABA）作用：1）抑制蛋白质的合成；2）抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用；3）诱导休眠、促进衰老与脱落。植物激素46第46页，课件共75页，创作于2023年2月培养基支持材料：最常用的是琼脂，浓度一般为1%左右。辅助性物质：抗生素抗氧化物活性炭

常用种类：青霉素链霉素庆大霉素等

用量：5－20%

注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重.常用半胱氨酸（VC）（50－200mg/L液洗涤外植体伤口表面）作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖；促进生根；防止组培苗玻璃化，利于胚胎培养。常用浓度：0.5－10g/L

注意：活性炭具副作用。47第47页，课件共75页，创作于2023年2月培养基的PH培养基的PH值，直接影响离子的吸收，过酸过碱对材料的生长都不利。对大多数植物来说，灭菌之前培养基的PH调到5.6—6.0能达到要求。主要用KOH和HCl来调节。一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时琼脂不能很好的凝固。48第48页，课件共75页，创作于2023年2月培养基的种类第一类为含盐量高的基本培养基，如MS、LS、BL、ER。第二类为硝酸钾含量高的基本培养基，如B5、N6、SH。第三类是无机盐中等含量培养基，如H基本培养基和尼许（Nitsch）基本培养基。第四类为低盐含量基本培养基，如White、WS和HE基本培养基。49第49页，课件共75页，创作于2023年2月基本培养基的选择培养基的选择（1）在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了尽快建立起再生体系，最好选择常用的一些培养基，如MS培养基；（2）如果MS培养基不理想，可首先降低它的浓度；（3）其次再选择在配料成分上与MS有显著不同的其它培养基加以试用对比。50第50页，课件共75页，创作于2023年2月基本培养基的选择激素浓度和相对比例的确定

在试验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同的植物、相同的组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3－5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。培养基的选择51第51页，课件共75页，创作于2023年2月16种激素配比实验方案生长素浓度（mg/L）细胞分裂素浓度（mg/L）0.51.534.5012340.556781.091011122.01315151652第52页，课件共75页，创作于2023年2月体积百分比浓度重量百分比浓度摩尔浓度培养基的配制方法（1）培养基成分的浓度换算53第53页，课件共75页，创作于2023年2月大量元素母液的配制微量元素母液的配制

铁盐母液配制植物生长调节物质及其

他有机物质母液的配制培养基的配制方法（2）培养基母液的配制

一般配成比所需浓度高10-100倍的母液，用时可按比例稀释。54第54页，课件共75页，创作于2023年2月（3）培养基的配制程序称琼脂和蔗糖加热溶解加水定容加入一定量的各种贮备液调pH分装灭菌55第55页，课件共75页，创作于2023年2月3.培养材料的接种取材灭菌把外植体接种在培养基中污染的预防：严格进行无菌操作。极性对培养的影响56第56页，课件共75页，创作于2023年2月4.种质资源的离体保存4.1

概述4.2植物种质资源的离体保存常温限制生长保存低温保存超低温保存57第57页，课件共75页，创作于2023年2月4.1

概述

4.1.1种质资源的重要作用种质资源(基因库):是选育新品种的最基本的原始材料。有人说：“人类的命运将取决于人类理解和发觉植物种质资源的能力。”选育新品种时利用的材料单位是性状，如颜色、高矮、早熟性和抗病性等。选育新品种需要原始材料—已有的栽培品种、半栽培类型和有关野生植物。只要其具有一些能结合到栽培品种上的有用性状，就都可以作为原始材料。58第58页，课件共75页，创作于2023年2月

种质：是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。4.1.2相关概念植物种质资源：即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。种质资源保存：是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。59第59页，课件共75页，创作于2023年2月4.1.3种质资源的保存方式原生境保存：将植物的遗传材料保存在它们的自然环境中。原生境保存的地方多是植物保护区，另一种方法为农田种植保存。非原生境保存：将植物的遗传材料保存在不是它们的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物园、种质圃、种子(质)库、试管苗库、超低温库等。具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离体保存和基因文库保存。60第60页，课件共75页，创作于2023年2月定义：是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。4.2种质资源的离体保存61第61页，课件共75页，创作于2023年2月离体保存的意义：可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资源的丢失。节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。一旦利用可快速繁殖；也利于种质交换。62第62页，课件共75页，创作于2023年2月常温限制生长保存低温保存超低温保存离体保存的方法：63第63页，课件共75页，创作于2023年2月4.2.1常温限制生长保存常温限制生长保存的概念

正常条件下由于材料生长很快，需经常继代，增加了工作量及费用，不适合种质资源保存。通过提高渗透压、添加生长延缓剂或抑制剂、干燥、降低气压、改变光照条件等，限制培养物的生长，使转移继代的间隔时间延长达到保存种质的方法。64第64页，课件共75页，创作于2023年2月4.2.2低温保存低温保存的方法和原理低温保存的概念用离体培养的方式在非冻结程度的低温下(一般为1-9℃)保存种质的方法。

方法简单，存活率高.

低温使植物生长速度受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的.65第65页，课件共75页，创作于2023年2月4.2.3超低温保存种质资源超低温保存的概念：

植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温（-80～-196℃液氮）条件下进行保存的方法。66第66页，课件共75页，创作于2023年2月

在极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官在超低温保存过程中不会产生遗传性状的改变，保存了原材料的遗传特性。同时，由于超低温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢，甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。种质资源超低温保存的原理67第67页，课件共75页，创作于2023年2月

在低温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结构，造成不可逆性破坏。怎样才能避免超低温冷冻保存对细胞造成的破坏呢？68第68页，课件共75页，创作于2023年2月69措施：①提高植物材料的抗冻能力；②选择细胞内自由水少的植物材料；③在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成，避免对细胞的损伤。第69