实验一细菌基本检验技术一

实验一细菌基本检验技术一第1页，课件共34页，创作于2023年2月一、常用消毒灭菌方法介绍

消毒与灭菌的方法

加热

物理方法过滤

照射

化学方法一）加热法

加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。第2页，课件共34页，创作于2023年2月1、干热灭菌

火焰烧灼灭菌

热空气灭菌160℃-170℃2小时

适用于玻璃器皿如吸管和

培养皿等的灭菌2、湿热灭菌

高压蒸汽灭菌法

间歇灭菌法

煮沸消毒法第3页，课件共34页，创作于2023年2月高压蒸汽灭菌法1.05kg／cm2(15磅/英寸2)，121.3℃保持15-30分钟；0.7kg／cm2(10磅/英寸2)，115.6℃保持20-30分钟；适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌；指示菌：菌种采用USP（美国药典）31版和ISO11138（国际标准组织）指定的嗜热脂肪芽孢杆菌（ATCC7953），本菌芽孢对热的抗力较强，其热死亡时间与病原微生物中抗力最强的肉毒杆菌芽孢相似。第4页，课件共34页，创作于2023年2月间歇灭菌法阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌；100℃30分钟

室温下18-24小时100℃30分钟

室温下18-24小时100℃30分钟；

有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。煮沸消毒法煮沸消毒时间为10-15分钟；注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。第5页，课件共34页，创作于2023年2月二）过滤灭菌

蔡氏(Seitz)过滤器

膜过滤器：多孔纤维素(乙酸纤维素或

硝酸纤维素)，孔径一般为

0.45m/0.22m许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。第6页，课件共34页，创作于2023年2月三）紫外线灭菌（照射）紫外线波长在200-300nm，具有杀菌作用，其中以265-266nm杀菌力最强；照射剂量(J/m2)=照射时间（s）×UVC照射强度（w/m2）；适应于室内空气、物体表面和水及其它液体的消毒。第7页，课件共34页，创作于2023年2月四）化学方法

常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表类

别实

例常用浓度应用范围醇

类乙

醇50-70%皮肤及器械消毒酸

类

乳

酸0.33-lmol/L空气消毒(喷雾或熏蒸)食

醋3-5m1/m3熏蒸消毒空气，可预防流感病毒碱

类石灰水1-3%地面消毒酚

类石炭酸5%空气消毒(喷雾)来苏尔2-5%空气消毒、皮肤消毒醛

类福尔马林40%溶液2-6ml/m3

接种室、接种箱或厂房熏蒸消毒重金属离子升

汞0.1%植物组织(如根瘤)表面消毒硝酸银0.1-1%皮肤消毒氧化剂高锰酸钾0.1-3%皮肤、水果、茶杯消毒过氧化氢3%清洗伤口氯

气0.2-1ppm饮用水清洁消毒漂白粉l-5%洗刷培养基、饮水及粪便消毒去污剂新洁尔灭水稀释20倍

皮肤，不能遇热的器皿消毒染

料

结晶紫2-4%外用紫药水，浅创伤口消毒金属螯合剂8-羟奎啉硫酸盐

0.1-0.2%外用、清洗消毒第8页，课件共34页，创作于2023年2月二、微生物实验中常用器材的准备

实验目的：熟悉微生物实验中常用器材；了解各种器材在使用前的准备及清洁工作。实验内容：玻璃器皿的清洁法1、新玻璃器皿：因含有游离碱，应先在清洁液或2%盐酸内浸泡数小时，再用自来水清洗干净。第9页，课件共34页，创作于2023年2月2、用过的玻璃器材：凡培养了细菌或污染有活菌的玻璃器皿，均可直接投入5％碳酸氢钠水锅中煮沸30分钟，趁热倒出器皿内的内容物，再用热肥皂水洗刷，最后用自来水冲洗干净。沾有凡士林或石蜡的器皿，应单独高压灭菌，然后趁热倒出内容物，将试管等倒立于吸水纸上置100℃烤箱内半小时，吸出油污，再放入5％碳酸氢钠水中煮两次，然后用肥皂水洗刷干净，凉干或烤干备用。第10页，课件共34页，创作于2023年2月染有活菌的吸管应投入3％来苏液内浸泡30分钟，再用肥皂水洗涤一次，最后用自来水冲洗干净。

染有活菌的玻片，可浸入3％来苏液或清洁液中过夜，取出后水洗。细菌染色之载玻片放入5％肥皂水中煮沸10分钟，刷洗干净，再清水冲洗，最后浸入95％酒精中片刻，取出软布擦干备用。第11页，课件共34页，创作于2023年2月玻璃器皿的包扎和灭菌培养皿（简称平皿）：包扎：培养皿由盖皿和底皿组成，先将盖皿和底皿套合后，数个（10个或15个或随意性）一叠用纸包裹或装在金属的平皿框架内。灭菌：160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽灭菌15磅/寸2灭菌20分钟，再置烤箱内烤干备用。第12页，课件共34页，创作于2023年2月试管：包扎：培养用的试管，其管口必须用棉塞塞紧。棉塞制作法：取大小合适的棉花块（视管口口径大小而定），松松地卷成圆筒，将两端毛边略向内折入，再逢腰折转，在折端套一大小合适的纱布块，塞入试管口内，纱布的散端可用线扎紧，剪去须尾。棉塞的要求：①、要有适当的长度，2/3塞入试管内，1/3露于管口外；②、大小适宜，应手持棉塞外露部分时试管不掉离棉塞，同时又能轻轻拔出（过松达不到滤菌的目的，过紧妨碍空气流通）；第13页，课件共34页，创作于2023年2月吸管及毛细吸管：

包扎：（管口要求塞棉花）以拇、食指持一端拉直的回形针，并以食指夹取少许棉花（根据吸管孔径大小确定棉花多少），轻轻从管口端塞入1.5～2cm，抽出回形针。塞入的棉花松紧必须适中，过松时使用中棉花容易脱落，过紧时吹吸时流速太慢，管口露出的棉花纤维可在酒精灯火焰上烧去。管口塞好棉花后将吸管尖斜置于一条约4×40cm左右的纸条上，离终端4cm，将纸条包住吸管的尖端向前稍微滚动，使将管尖包裹，再将纸条末端折叠包严吸管尖端，将吸管继续滚动至纸将吸管全部包严。第14页，课件共34页，创作于2023年2月烧瓶：包扎：按瓶口大小，用上述方法制成棉塞塞入瓶口，再在棉塞外包以厚纸，用纱绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外界细菌污染。第15页，课件共34页，创作于2023年2月棉签（棉拭）：棉签制作：取稍许脱脂棉，做成一定形状置于左手中指上，用一竹签自前向后卷入少许棉花，然后将竹签前端棉花折入，再继续滚动棉签（滚动过程中以食指抵住竹签前端）直至将所取棉花全部卷紧即成。包扎：取15～20根棉签，用纸包好或插入试管内，塞好棉塞，灭菌备用。第16页，课件共34页，创作于2023年2月三、常用培养基的制备

实验目的：了解细菌培养基的制备原则和基本程序，熟悉常用培养基的种类与名称。熟悉葡萄糖发酵管、肉汤、普通琼脂培养基等的配制第17页，课件共34页，创作于2023年2月培养基配制的基本程序称量（按一定配方称量各种物质）→溶解→测定及调整PH→滤过→分装→灭菌、备用。第18页，课件共34页，创作于2023年2月四、细菌的接种培养与生长现象观察

实验目的：初步掌握细菌接种的无菌操作技术要领；学会常用的几种接种细菌的方法；学会观察和描述细菌在不同培养基中的生长情况。第19页，课件共34页，创作于2023年2月实验材料：菌种：金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的24h斜面培养物培养基：普通琼脂平板、肉膏汤、半固体培养基及普通琼脂斜面培养基其它：接种环、接种针、特种蜡笔、酒精灯、37℃恒温培养箱等第20页，课件共34页，创作于2023年2月实验方法：细菌接种与培养方法1、液体培养基（肉汤）的接种方法：主要用于增菌培养及检测细菌的生化反应左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管使菌种管在外，培养基管位里。右手拇、食指先转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。右手持接种环，烧灼灭菌，柄部也要迅速通过火焰2~3次杀灭表面的杂菌，灭菌后拿在手中，勿与其它物接触。第21页，课件共34页，创作于2023年2月以右手无名指与小指拔取菌种管棉塞，再用手掌与小指拔取待接种管，随后将两管管口迅速通过火焰灭菌。用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取不许菌苔，退出管后再伸入肉汤管中，在接近液面与管壁处轻轻研磨（图1）并沾取少许肉汤调和，使菌混于肉汤中。接种毕，接种环灭菌后放下。分别塞好棉塞，立于试管架上，37℃孵育18~24小时，观察生长情况。第22页，课件共34页，创作于2023年2月图1液体培养基接种法第23页，课件共34页，创作于2023年2月2、半固体培养基接种法：只能用接种针接种，主要用于细菌动力观察，保存菌种左手握持菌种管及待接种管（方法同前）右手持接种针火焰灭菌，挑取少许菌苔，于待接种培养基中心垂直插入（图2）近管底处，然后转动接种针原路退出；接种毕，接种针灭菌后放下，分别塞好棉塞。37℃孵育18~24小时，观察有无细菌生长，细菌有无动力。第24页，课件共34页，创作于2023年2月图2半固体培养基接种方法第25页，课件共34页，创作于2023年2月3、斜面培养基接种方法：主要用于纯培养和细菌菌种保存如液体培养基接种法，左手握持菌种管及待接种管。用灭菌后冷却的接种环伸入菌种管，从斜面上挑取不许菌苔，退出管后再伸入待接种管，自斜面底部轻轻向上部蜿蜒划线或自斜面底部轻轻向上部划一直线，再回到斜面底部向上部蜿蜒划线（勿触破培养基表面，沾菌的接种环进出试管时不应触及度管内避）。接种毕，接种环火焰灭菌后放下。两管口迅速通过火焰2~3次灭菌，先将指掌间棉塞塞入接菌管内，后将无名指、小指间棉塞塞入菌种管上，将管放回原处。37℃孵育18~24小时，观察生长情况。第26页，课件共34页，创作于2023年2月图3斜面培养基接种法第27页，课件共34页，创作于2023年2月4、琼脂平板接种方法：只能用接种环接种连续划线法右手持接种环在火焰上灭菌待冷（约2~5秒钟）取稍许菌种。左手抓握平板培养基，微开皿盖，接种环与培养基表面成45度角，在平板一侧边缘反复来回划线（此称原划线），然后运用腕力向两侧作“Z”形划线，划线向下延伸，直至划完整个平板（注意划线不能接触平皿边缘，要匀直，不划烂培养基，要充分利用平板）第28页，课件共34页，创作于2023年2月

图4平板连续划线法图5培养后菌落的分布情况第29页，课件共34页，创作于2023年2月分区划线法

用接种环取菌做原划线后先在平板1/4面积处划线，再把平板旋转一定角度，将接种环在火焰上灭菌，冷却后做第二区划线，起始每条划线都与第一区划线相交，相交数次后划线不必再相交接，待第二区划线完时，灭菌接种环，按上法划第三区、第四区划线。第30页，课件共34页，创作于2023年2月图6平板分区划线法

图7培养后菌落的分布情况第31页，课件共34页，创作于2023年2月细菌的生长现象观察1、液体培养基中生长现象观察：培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长形式。混浊：液体变为混浊。菌膜：液体澄清，表面有一薄膜。沉淀：管底有沉淀物，液体澄清。第32页，课件共34页，创作于2023年2月2、半固体中生长现象观察：

无鞭毛（无运动）的细菌：经培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮。

有鞭