细胞工程-第六章-胚胎工程课件

第六章胚胎工程曹君迈6.1胚胎工程胚胎工程（embryoengineering）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。

胚胎工程的历史：1891年，英国剑桥大学的希普就在兔子身上首次成功地进行了受精卵的移植实验。20世纪30年代，一些学者相继在鼠、兔、绵羊、山羊、猪、牛和马等动物进行胚胎移植试验，获得成功。胚胎工程的意义：(一)发挥优良母畜的繁殖潜力(二)促进家畜改良的速度(三)作为胚胎操作的基础(四)保存遗传资源6.2胚胎工程的技术方法6.21人工受精6.22胚胎移植6.23胚胎分割6.24胚胎融合6.25动物性别与胚胎性别鉴定6.26胚胎冷冻保存技术

6.21人工受精1.精子2.卵母细胞3.体外受精1精子1)精子的获得：精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。3)精液的保存精液的保存可以分为常温（15－25℃）、低温（0－5℃）和超低温冷冻（－79℃－-196℃）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，营养剂包括糖类、奶类和卵黄等，保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、DMSO、糖类等。三种保存方法常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。2采卵1)输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。2)对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。2采卵3)对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。4)对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。3体外受精体外受精（invitrofertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。主要包括：成熟或未成熟的卵母细胞获得、体外培养系统的建立、处理附睾内和射出精子、使精卵结合——受精、受精卵的体内或体外培养（invitroculture，IVC）、移植妊娠和产仔由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为“试管动物”或“试管婴儿”。历史1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。过程获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液5μl精子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以BO液冲洗，用微吸管吸10个卵母细胞与少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培养箱中培养7小时后再经微量吸管自小滴中用BO液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（TCM－199＋10％FCS）继续培养。显微操作协助受精在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。1976年，Uehara和Yanagimachi将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。其它一些方法如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过30％的妊娠或出生率，而且并没有增加孤雌活化率和多精受精率。另外，可以用微细玻璃针或金属微刀片，在透明带上切开或挑开或撕开一个口，再经适当浓度精子受精。4）精卵融合过程A顶体反应后，精子穿过透明带进入卵周隙B以赤道段与卵质膜相融合C融合后CGs胞吐，核开始去致密D精子头部完全入卵，将一部分卵质膜带入。体外受精的意义可以用来研究受精机理，治疗人类男性和动物的生殖不育，可以利用体外受精卵的发育状况或染色体核型检测用来检测形态不正常精子其染色体是否正常，可以产生大量的转基因动物，还可以简化烦杂的冻精技术，或许只保存核物质，就可以达到受精的目的，这对保护珍贵的动物资源，将起到重要的作用。体外受精技术已经广泛应用于发育生物学、医学、畜产学、实验动物学等各个领域。6.22胚胎移植胚胎移植（embryotransfer，ET）一般是针对早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宫中取出，经过人为处理，可以再送入子宫的过程，这是胚胎生物工程的基本技术。1)超数排卵如果一次要获得多个卵，可以利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）

如在小鼠Ⅳ－Ⅴ期涂片相时注射5－10IUPMSG，48－50小时后，再于皮下或腹腔注射5－10IUhCG，这种方法可以获得超数排卵。人的人工采卵和超数排卵，要在月经期5－9天，每天给予100－150mg克罗米酚，11天或12天用B型超声检测卵巢表面的卵泡直径达到20mm时，再给予4000－9000IUhCG，32－40小时后取卵。2)同期发情胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情（oestrusynchronization），包括自然同期发情和人工同期发情。自然同期发情即不经任何药物处理，依靠动物自身的性周期规律，选择处于适当时期的母畜作为受体。实际操作中，多用性激素进行人工同期发情。以小鼠为例，将自然排卵或人工超排的小鼠与结扎输精管的公鼠交配，造成假孕。子宫移植时，一般选用假孕2.5天的母鼠。3)胚胎收集胚胎培养之前，先从动物子宫内将胚胎收集不同的动物其收集方法是不一样的。以小鼠为例，一般用颈部脱臼法杀死小鼠，开腹取出子宫和输卵管并将其各部分离，分别放于37℃生理盐水或M2＋BSA中，在实体显微镜下，用尖钟表镊子撕开输卵管，可以见到受精卵或卵裂胚胎，亦可以冲洗法将胚胎冲到平皿中。如冲洗囊胚，可用注射器针头自子宫角的输卵管端插入，推入0.2－0.5mlM2＋BSA液，将胚胎冲到平皿中。对于像牛等大型动物而言，如果要取受精卵或早期卵裂胚，应用手术方法冲洗输卵管或将牛杀死取出输卵管冲洗之。但6天后的胚胎，已经移行到子宫角前部，可以用非手术的方法取之。4)胚胎移植移植分为手术移植和非手术移植，在无菌条件下，向输卵管或子宫内用微吸管将吸入的胚胎注入，在小鼠、大鼠和仓鼠都应在动物背部开口，找出输卵管将胚胎移入向子宫内移植多在囊胚期，成功率较高，在小鼠和大鼠，可达到70％－80％。羊和猪一般是开腹进行手术移植，在牛，目前多进行非手术移植，但只适用于晚期胚胎(5日龄的牛胚胎)不适用于体形较小的动物。(1)手术法移植手术法是指将动物固定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手术部位。在背部或腹中线开口，将输卵管或子宫拉出体外。如果进行输卵管移植，把吸好胚胎的移植管由输卵管伞口插入管内，尽量插得深一些。然后把胚胎吹入输卵管内。移植时，应尽量少带入液体。如果进行子宫移植，在离子宫角与输卵管接合部约5cm处，先用钝头针扎一小孔，随即抽出，把移植管顺此孔插入子宫腔，吹入胚胎。复位、缝合。手术法一般是移植卵裂早期的胚胎。(2)非手术法移植-牛用人工受精管，通过子宫颈进入子宫体，然后注入胚胎，但只适用于晚期胚胎(5日龄的牛胚胎)。不适用于体形较小的动物。6.23胚胎分割同卵双生胚胎分割的原理根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。过程把经过软化处理的胚胎，与少量培养液一起置于载片上，把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，继续下切，胚胎就被压扁，继而被切开。再把切割的胚胎纳入空透明带。囊胚切割时，需将内细胞团一分为二，早期的囊胚的二分胚发育率，比桑椹胚的二分胚发育率要低，可能是因为囊胚正处于进一步的细胞分化状态，操作后胚胎的调整能力比桑椹胚差。相对而言，二分胚、四分胚比较容易培养，而八分胚的存活率很低。过程胚胎分割6.24胚胎嵌合(胚胎融合)嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为次生性嵌合体1901年，Spemann最早开始进行动物嵌合体的研究，他进行了蛙嵌合个体的培育，其目的是为了研究两栖类动物的发育机制。1960年，Mintz开始研究嵌合体制作技术，到1965年第一次获得活至成体的正常小鼠嵌合体。植入前胚胎嵌合体的制作方法1)聚合法第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5％链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有5μg/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作用，更易聚合。若放到37℃时，效果更佳，聚合完毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。2)囊胚注射法囊胚注射法是把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞。若注入的细胞并入内细胞团并参与胚体的形成，那么就形成了嵌合体。注射时，选取健康、生长良好的细胞。如果是培养细胞，应该保证其整二倍体性。将10－12个细胞吸入到注射吸管的顶端。用固定吸管吸住内细胞团与滋胚层交界处，让内细胞团位于囊胚的底部位置。调整注射吸管与固定吸管使处于同一焦点平面，选择滋胚层细胞间的“间隙处”，将注射吸管插入囊胚腔。将细胞推入囊胚腔，使之落到内细胞团之上。操作后的囊胚形态不规则，经短期培养后，可以恢复正常状态。制作过程小鼠嵌合体的制作过程分析是否是嵌合体及嵌合的程度两种：色素分析法和遗传分析法色素分析法简单、直观，比较实用。一般选用肤色、毛色差异明显的动物的胚胎作为供体胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下4－5天后，就可以分析其肤色或毛色，怀孕10天左右的小鼠胎儿，眼睛就有色素沉积。或者在出生时，检查眼睑色素情况，确定是否是嵌合体。使用同工酶分析首先分析动物特定的同工酶谱系，然后选择具有不同图谱的两种或多种动物作为供体动物提供胚胎。如果获得的动物是嵌合体，那么同工酶谱中应显现与供体动物相对应的特定谱带，不同品种动物的同工酶均有表现。现在比较常用的是磷酸葡萄糖异构酶（GPI）分析，其原理是果糖－6－磷酸在GPI作用下，产生葡萄糖－6－磷酸，在6－磷酸葡萄糖脱氢酶和NADP作用下，使G－6－P成为6－磷酸葡萄糖酸盐，NADP还原为NADPH。经GPI染液染色，可显示出同工酶谱带。分析时，从嵌合动物中取不同组织器官，匀浆后制成电泳样本，在醋酸纤维素板上点样，电泳、染色处理。与标准的同工酶谱对照，鉴定是否是嵌合体。胚胎嵌合的意义胚胎嵌合技术可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力，研究性分化机制与性比，研究X染色体失活及其作用和研究胚胎细胞基因表达的机制；也可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；还可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；利用种间移植，分析胎儿和母体的相互关系。6.25胚胎保存保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。非冷冻保存是1948年，由M.C.Chang等开创的，他们将兔2细胞胚胎，在同种血清中37℃保存48小时，移植后产仔。非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法。1)异种动物体内保存法又称为中间受体培养法，是指把一种动物的胚胎，移入另一种动物的输卵管或子宫内，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的动物都能在另一种动物的输卵管或子宫内存活的。琼脂包埋移植法是指将胚胎移植到1％的琼脂液中，用口径适宜的微吸管把胚胎连同少量琼脂液一起吸入。当琼脂凝结后再将其压出，胚胎就被封入圆柱形琼脂小柱中，每个琼脂小柱放3－5枚胚胎，再把这个琼脂小柱封入较大的1.2％琼脂圆柱内。然后，通过胚胎移植技术，将琼脂柱移入中间受体输卵管中。移植前，预先结扎输卵管与子宫的接合部。直接移植法是不经琼脂处理，直接移入预先结扎过的受体输卵管中。经过短期培养后，将胚胎从输卵管内冲出，观察发育情况。对发育良好者，移植入同期发情的同种动物受体内，使其产仔。2)冷藏保存法低于室温，但还达不到冷冻阶段的温度对胚胎进行保存即为冷藏保存法，一般在0－10℃左右保存。由于低温，可以抑制物质代谢的速度和细胞分裂的速度，因之可以延长保存时间。冷冻法冷冻法是指－196℃保存胚胎，在进行超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂处理。一般说来，在－80℃以上时，细胞则逐渐失去活力，到－130℃以下，细胞内的水分呈微细冰晶样或玻璃样结构，细胞内所有需要能量的反应停止，细胞的活动也几乎停止。最早，小鼠中获得成功。冷冻过程中细胞受到的损害在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害。快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻的化学损伤。防止冷冻损伤在冷冻液中，可以加入冷冻保护剂，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生，这种促使溶液结冰的方法称为诱发结晶或植冰（seeding）。一般，在－3℃――7℃之间诱发结晶。现在，