第五章-抗-体-制-药幻灯片

第五章抗体制药第一节

概述

1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。

抗体指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。它是机体免疫系统受抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。病人血清中具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）。Ig是化学结构的概念，而抗体是生物学功能的概念，所有抗体是Ig，但并非所有Ig分子都有抗体活性。由于病原微生物是含有多种抗原决定族的抗原物质，因此制的这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，故称为多克隆抗体。易出现非特异性交叉反应。1975年KöhlerandMilstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。

McAb在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：

A、McAb均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5~6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题：

A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3。第二节单克隆抗体（MonoclonalAntibody）一、制备单克隆抗体的一般流程

McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定族的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，故称为单克隆抗体。。1、抗原与动物免疫免疫方法：体内免疫和体外免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养

基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107~3×107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。

用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。PEG的相对分子质量和浓度越大，其促融和率越高。但其黏度和对细胞的毒性也随之增大。常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。相对分子质量在400~6000，浓度在10%~60%范围内的PEG都能使细胞发生融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加入DMSO（二甲基亚砜），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。（1）细胞融合液中的细胞类型：4或5种。（2）如何去除脾-瘤融和细胞以外的细胞？常用选择性培养基3、筛选阳性克隆与克隆化常用的检测方法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术常用的克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。

4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定—染色体分析

正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。

杂交瘤细胞的染色体数目：接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。

染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反。5、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法：可获得10µg/ml的抗体。多采用RPMI1640培养液，添加10%--20%胎牛或小牛血清。但由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100µg/ml以上，给纯化带来困难。加入小牛血清又是发生支原体污染的原因，而且批间质量差异太大，直接影响杂交瘤细胞的生长。改良的方法有：无血清培养法、悬浮培养法、微载体悬浮培养法。无血清培养法：利用白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。此法虽可减少污染，但产量不高。悬浮培养法：连续悬浮培养的细胞密度可达2×107/ml,收集的单克隆抗体可达400µg/ml。如在培养液中加入微载体，细胞密度可达108/ml。（2）动物体内诱生法：可获得10µg/ml的抗体。常用基本程序：接种前1~2周，小鼠腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或用液体石蜡，然后注射1*106杂交瘤细胞，7~12d便有腹水生成，待生成腹水后再提取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。优点：操作简便，比较经济，所得单克隆抗体量多且效价高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株。缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。6、单克隆抗体的纯化根据Ig的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法。体外诊断试剂IgG类沉淀处理+亲和层析IgM类沉淀处理+凝胶过滤体内诊断试剂或治疗用药亲和层析+阴离子交换层析，注意除去毒素、病毒、核酸等微量的污染物。

动物体内诱生法制备的McAb纯化的一般程序：

（1）澄清和沉淀处理：a.1000g离心5min，去除沉淀物（红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块和脂质）b.20000g高速离心30min,去除残留的小颗粒物质c.用0.2µm微孔滤膜过滤，去除细菌、支原体d.饱和硫酸铵沉淀抗体（50%饱和硫酸铵能回收90%以上的抗体）。

（2）分离A、凝胶过滤：用于IgG和IgM类。常用SephadexG200作为分离介质，可收集到3个峰，最高峰为IgM，另外两个峰为IgG。抗体回收率达50~80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。B、阴离子交换层析：用于IgG类的分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度下洗脱下来，其纯度很高。IgG2b和IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。C、亲和层析：多用蛋白A亲和层析。适用于IgG类。IgG类与蛋白A的结合与pH有密切的关系。鼠源性单抗在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合在蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱下IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度和很高，但也有极微量的杂蛋白。二、鼠源性单克隆抗体的改造

目的：一是降低免疫源性；

二是降低相对分子量，增加组织通透性。

原理：抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的可变区（V），同种性免疫源性则决定于抗体分子的稳定区（C）。

鼠源性单克隆抗体的改造1、人—鼠嵌合抗体（chimericantibody）：在基因水平上把鼠源性单克隆抗体的H和L链的V区基因分离出来，分别与人Ig的H链和L链的C区基因连接，即成为人—鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的ChimericAntibody.2、改型抗体(Reshapingantibody)：Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区(CDR区)。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中的CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源部分只占很小比例，可基本消除免疫源性。这种改型抗体也称CDR移植抗体(CDRgraftingantibody)。3、小分子抗体：基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80~1/3。(1)Fab片段抗体：VH+CH1(3)单链抗体：VH-Linker-VL(2)FV抗体：VH+VL(4)单域抗体：VH或VL（5）最小识别单位（MRU）：单个CDR区构成

4、双功能抗体：双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)。是一种非天然性抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。

5、抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴。是20世纪90年代发展的研究领域。类型如下：（1）配基—配基型融合蛋白，如CD4-Fcγ.（2）配基—Ig型嵌合抗体，如IL-2-Ig（3）配基—FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3(4)受体—FV型融合蛋白（5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）第三节基因工程抗体和抗体工程抗体研究的三个阶段：①以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体；②以1975年Köhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；③以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表。它是抗体研究领域的一次技术革命，它不用人工免疫动物和细胞融合技术，完全用基因工程技术制备人源性抗体，而且还能利用基因转移和表达技术，通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。他创建了噬菌体抗体库（Repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技术,克服了人体不能随意免疫的缺点，用人外周血制备抗体文库，从而获得人源性基因工程抗体。

一、噬菌体抗体库技术的基本方法

1、获取目的基因

2、抗体库技术的载体：

3、淘筛（panning）：

4、表达与鉴定：。WesternBlotting免疫印迹与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、噬菌体抗体库技术的特点1、模拟天然全套抗体库：抗体文库可以达到或超过1011库容，所以能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，这是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：由于抗体库的大容量和极高的筛选效率，使得可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。抗体诊断试剂和抗体治疗药物

第四节一、抗体诊断试剂

抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物习惯上体外试验用的称试剂，体内导向诊断用的称药物。

1、血清学鉴定用的抗体类试剂（1）鉴定病原菌用的抗体试剂A、常用诊断血清的品种和用途B、诊断血清的制备步骤a、制备细菌抗原：细菌接种培养收集菌苔-沸水2.5h--制成菌液。b、免疫动物和制备抗体血清：抗原稀释后免疫动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注射后6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。C、诊断血清的诊断方法：直接凝集反应，镜检（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊断试剂A、试剂制备原理：红细胞经甲醛处理后，在酸性条件下能吸附蛋白质，当纯化的抗HBs血清吸附其上时便具有抗体活性，若待测样品中存在有HBsAg时，则发生特异性结合而使血细胞发生凝集。B、制备步骤：先用HBsAg免疫豚鼠获得抗HBs血清硫酸铵盐析/柱层析取其IgG在pH4.0醋酸缓冲液中致敏醛化血细胞洗去多余蛋白成分，用含1%兔血清的稀释液稀释至一定浓度，分装即成。C、诊断方法：RPHA（reversepassivehemagglutination)反向被动血凝试验，即用纯化的抗体致敏醛化血细胞测定相应抗原在V型血凝板上进行，阴性样品不凝集，血细胞沉积于V型孔底部，呈尖点状；阳性样品血细胞凝集成块状。

（3）妊娠诊断试剂

妇女妊娠后，血液和尿液中的HCG含量增高，在3个月内可达到高峰。此时检测尿液中的HCG，就可确定是否怀孕（4）抗ABO血型系统血清2、免疫标记技术用的抗体类试剂给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反应放大，使常规不能观察的反应得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，灵敏度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。除临床诊断外，还能为探讨发病机制提供手段。

（1）荧光抗体诊断试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达到诊断和定位的目的。（2）免疫酶抗体诊断试剂：用酶标记抗体检验抗原的方法a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊断试剂c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂d、测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂用于原发性肝癌的辅助诊断f、CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂用于消化道恶性肿瘤的鉴别诊断（3）放射免疫用抗体诊断试剂

把放射性核素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。常用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊断试剂：125I标记，灵敏度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素标记抗体诊断试剂：125I标记，灵敏度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素标记抗体诊断试剂：125I标记d、AFP放射性核素标记抗体诊断试剂：125I标记，灵敏度1~5ng/mle、CEA放射性核素标记抗体诊断试剂：125I标记，灵敏度1ng/3、导向诊断药物由于肿瘤的特异