肝功能实验设计课件

肝功能实验设计一、中英文摘要

目的:应用生物化学检验方法对肝功能进行检查。方法:

1.改良赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移氨酶(ALT)活性2.次氯酸盐直接显色法测定血氨3.酶连续循环法反应(液体双试剂法)测定总胆汁酸(TotalBileAcid,TBA)Abstract:

…Objective:

Applicationofbiochemicaltestsofliverfunctionbechecked.

….Activity:

1.Laiimprovedmethodformeasuringserumalanineaminotransferaseammonialyase(ALT)

2.Directcolorhypochloriteammoniadetermination

3.Continuousenzymereactioncycle(liquidtwo-reagentmethod)determinationoftotalbileacid(TotalBileAcid,TBA)二、实验设计

1.肝功能检查项目的选择（1）丙氨酸氨基转移氨酶(ALT)（2）血清氨（3）总胆汁酸(TotalBileAcid,TBA)（1）丙氨酸氨基转移氨酶(ALT)

ALT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍,肝脏发炎时，ALT就会从肝细胞释放到血液中，因此，ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标故测定ALT的活性，能很好反映肝功能的情况（2）血清氨血氨的主要来源是氨基酸的分解代谢。肝脏是体内利用氨合成尿素的惟一器官,在肝硬化、重症肝炎、原发性肝癌、肝性脑病,肝脏清除氨的能力下降,血氨会升高,过度增高可引起肝性脑病,对严重的肝病和肝性脑病有很好的协助诊断作用，故它的测定具有重要的临床意义。指标1:丙氨酸氨基转移氨酶活性方法:血清丙氨酸氨基转移氨酶(ALT)活性的测定

（改良赖氏法）仪器：723型分光光度计电热恒温水浴箱高速离心机试剂：1.0.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液2.标准丙酮酸（含丙酮酸2.0μmol/ml）3.ALT底物液（含α-酮戊二酸2μmol/ml及DL-丙氨酸200μmol/ml）4.2.4二硝基苯肼溶液5.0.4mol/LNaOH溶液(样本)血清实验原理血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,4二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与ALT活性的高低成正比关系

实验操作

1.取空腹静脉血2ml，经离心分离得到血清，保存于冰箱中待用，因为血细胞中转氨酶活性较血清中高，故应防止溶血。若血清中此酶活性过高，则可适当稀释后再用。2.取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管。实验结果1.赖氏法测定ALT的标准曲线(即计量反应曲线)在坐标纸上以上表中An－A0之值为纵坐标，相应的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法测定ALT的标准曲线2.标本中ALT活性结果⑴查标准曲线利用测定所得的吸光度结果(AU－AB)，便可从标准曲线上查得标本的ALT结果⑵计算将实验测得的AU－AB、AS代入下面计算公式，即可算得标本中ALT活性

参考值.5～25卡门氏单位卡门氏单位的定义是：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径1cm的条件下，1ml血清使NADH的吸光度下降0.001的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1卡门氏单位=0.4821IU/L(25℃)，便可将卡门氏单位兑换成国际单位评价：改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性，所用试剂价廉，易得，可见光比色，不需要特殊仪器，适合学生实验室操作的练习。医院常规方法：紫外连续监测法（该法特异精密度更高，但测定成本较高，一般需要昂贵的自动生化仪）指标2：

血清的氨

方法:次氯酸盐直接显色法测定血氨仪器：723型分光光度计电热恒温水浴箱PHs一3C型精密酸度计试剂：1．3mol／L钨酸钠溶液2．5mol／L硫酸溶液显色剂I(含苯酚10g／L，亚硝酰铁氰化钠50mol／L)；3.显色剂ⅡA(含次氯酸钠0.Olmol／L，氢氧化钠4．28mol／L)5.显色剂ⅡB(含次氯酸钠0．Olmo1／L，氢氧化钠0．36mol／L)；6.硫酸铵标准液(含NH4+300~mol／L)全部试剂均为分析纯，用无氨蒸馏水配制，所有器材和容器均用无氨水冲洗烘干后备用样本

:血清实验原理:血液离体后，立即加入定量过量的钨酸钠及硫酸溶液，使蛋白沉淀的同时，血液中的氨与硫酸形成硫酸铵而存留于血滤液中，再以酚-次氯酸钠显色后于波长630nm处测定A值（以空白校正）。实验操作:1.在3支试管(分别写明测定、空白、标准)中加入O．3mol／L钨酸钠溶液和0．5mol／L硫酸溶液各lmL。在测定管中加入临时抽出的血液0．5mL后立即加盖混匀，2500r／min离心5min，上清液留做测氨用。在空白管中加入0．5mL蒸馏水，标准管中加入0．5mL硫酸铵标准液，混匀，分别得到空白混合液和标准混合液2.另取3支试管，标明测定、空白、标准。于测定管中加入上清液0．5mL，显色剂I和显色剂ⅡA各lmL，边加边混匀于空白管中加入空白混合液O．5mL，标准管中加入标准混合液0．5mL，然后在两管中加入显色剂I和显色剂ⅡB各lmL，边加边混匀。3.将上述各管置37℃水浴30min，冷却后于635nm波长处用lcm比色杯，空白调零，测定吸光度。4.按下式计算血氨浓度：血氨（μmol/L）=A测定管/A标准管×300评价：1.本法采用两种碱浓度不同的次氯酸盐溶液分别测定标准和血液样品，保持了显色溶液酸度一致性因而提高了血却氨测定的准确度，回收率达98.5%~101.3%2.医院常规方法：血氨常规测定方法大体分为两类，即液体试剂（谷氨酸脱氢酶法）和干化学法。以干化学法为主，但仪器昂贵，小的仪器干式仪器2～10万，大的数十万指标3:血清总胆汁酸方法:酶连续循环法反应(液体双试剂法)所用试剂:

总胆汁酸酶连续循环比色法定量检测试剂盒注:(开封后直接使用,有效期限:开封后存放于4℃，1个月)R1：缓冲液PH7.0,65mmol/L。Thio-NAD1g/L

R2：缓冲液PH7.0,65mmol/L。Thio-NADH6g/L。叠氮钠0.6mmol/L。3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）≥5000U/L

原理:测定原理:胆汁酸与3α-羟基类固醇脱氢酶（3α-HSD）及氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Thio-NAD）发生反应，生成3-酮胆汁酸和还原型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Thio-NADH）。3-酮胆汁酸在3α-HSD和NADH作用下，还原生成胆汁酸及NAD+。测定生成物Thio-NADH在405nm的吸光度变化率，与样本中胆汁酸浓度成正比。

操作步骤：

1.S+R1在37℃保温5分钟，加入试剂2(R2)2.S+R1+R2在37℃保温60秒，记录吸光度值A1后，180秒后记录吸光度值A2。

注：标本量(S)：4ul试剂1(R1)：270ul试剂2(R2)：ul90主波长：405nm副波长：660nm正常值范围：0-15umol/L线性范围：200umol/L计算:

ΔA标本总胆汁酸浓度=--------------×校准液浓度

ΔA校准

注：（ΔA=A2－A1）正常值:

0-10mmole