基因工程实验

基因工程实验第1页，课件共41页，创作于2023年2月基因工程实验周景文江南大学生物系统与生物加工研究室10July2023第2页，课件共41页，创作于2023年2月概述PCRDNA/RNA的凝胶电泳质粒提取基因组提取常用工具酶怎样把一个基因连接到质粒上？怎样把几个片段连接到一起？基因敲除过量表达质粒的结构常用软件常用网址常用供应商第3页，课件共41页，创作于2023年2月1.PCR酶的选择：普通的DNA聚合酶：Taq

末端有A尾，可以直接用于TA克隆，连接到T载体上；高保真的DNA聚合酶：Pfu(Pyrobest)

末端无A尾，无法直接连接至T载体上。反应条件的选择：Mg2+:过低反应无法进行，过高易产生错配；Mn2+:使错配率增加，用于易错PCR，进行定向进化。第4页，课件共41页，创作于2023年2月特殊的PCR：融合PCR(与SOE-PCR原理一致)：见文献：Shevchuk,N.A.,A.V.Bryksin,etal.(2004)."ConstructionoflongDNAmoleculesusinglongPCR-basedfusionofseveralfragmentssimultaneously."NucleicAcidsRes

32(2):12.Szewczyk,E.,T.Nayak,etal.(2006)."FusionPCRandgenetargetinginAspergillusnidulans."Nat.Protoc.

1(6):3111-3120.2.巢式PCR

目前已经较少用到。3.易错PCR(Error-PronePCR)

用于随机突变。通过控制Mg2+和Mn2+的浓度实现。第5页，课件共41页，创作于2023年2月2.DNA/RNA凝胶电泳电泳基质主要分为琼脂糖和聚丙烯酰胺两类平常我们主要用琼脂糖凝胶电泳琼脂糖浓度的选择一般按下表，1%的琼脂糖最为常用，可以分离分子生物学操作中常见的片段大小。琼脂糖浓度/％0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb60~520~110~0.87~0.56~0.44~0.23~0.1琼脂糖浓度与DNA分离范围Marker的大小应根据预计片段的大小进行选择质粒或其它环状DNA的大小不能根据Marker进行判断！第6页，课件共41页，创作于2023年2月3.质粒提取细菌：碱裂解法；试剂盒；破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母酶破壁+碱裂解法；试剂盒；破壁一般采用Lyticase(有的公司称为Zymolyase)或玻璃珠法；后续步骤基本相同。第7页，课件共41页，创作于2023年2月4.基因组提取细菌：试剂盒；破壁一般采用溶菌酶(Lysozyme)。酵母试剂盒；破壁一般采用Lyticase(有的公司称为Zymolyase)或玻璃珠法；后续步骤基本相同。第8页，课件共41页，创作于2023年2月5.常用工具酶基因工程中常用到的工具酶包括：Lysozyme/溶菌酶：用于酵母和植物破壁用的裂解酶；Lyticase：用于酵母和植物破壁用的裂解酶；RNA酶：用于降解提取DNA中的RNA；DNA酶（DNA外切酶）：用于去除RNA或蛋白质样品中的DNA；DNA聚合酶：用于PCR，常用Taq和Pfu；反转录酶：用于从mRNA反转录得到cDNA；各种限制性内切酶；连接酶；碱性磷酸酶：用于连接前处理，常用CIAP（小牛肠碱性磷酸酶）；共性：除RNA酶和Taq/Pfu之外，基本上都对热不稳定，需要在-20C保存，使用时也需要尽量放置冰上！第9页，课件共41页，创作于2023年2月5.1限制性内切酶定义：限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。[单位定义]：在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。详见：/view/48578.htm最常用的内切酶：BamHI、EcoRI和HindIII价格最便宜，最容易切开，最容易连上！如果有可能，尽可能优先考虑这3种内切酶。第10页，课件共41页，创作于2023年2月5.2连接酶定义：又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与ATP的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（ATP)的高能磷酸键的断裂如DNA连接酶等。在基因操作中，特指能将两个片段通过粘性末端或平末端连接起来的一类酶。通常用于将DNA片段连接到质粒上。目前主要用的是一种来源于T4噬菌体的连接酶，通常称为“T4DNA连接酶”。第11页，课件共41页，创作于2023年2月6.怎样把一个基因连接到质粒上？Taq，ExTaq，LA-Taq的PCR产物，直接连接至T载体上；各家公司对T载体的命名方式不一样，需要仔细查看相关的说明文件。设计了酶切位点的PCR产物：单酶切后插入经过相应酶切后的载体上；

此处需要用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，一般用CIAP；双酶切后插入经过相应酶切后的载体上；

原则上需要用碱性磷酸酶处理酶切后的载体，但双酶切中基本上忽略，但对于一些酶切效率较低的酶，最好处理载体；通过同源重组连接入载体：在PCR引物两端设计与酶切后载体同源的序列(15-20bp)，通过同源重组酶连接至载体上(Invitrogen称为Topo克隆，Gateway克隆)。第12页，课件共41页，创作于2023年2月7.怎样把几个片段连接到一起？酶切连接：设计多个不同的酶切位点，将相应的PCR片段用酶切的方法一段一段的连入载体中，最后再用两端的引物进行PCR，得到最终所需的片段融合PCR/重叠延伸PCR片段两端与需要连接的片段有15–20bp的同源序列；用高保真酶先得到待连接的片段；以等摩尔的待连接片段为模板，用两端的引物进行PCR，可以得到连接后的PCR片段。第13页，课件共41页，创作于2023年2月8.基因敲除目的：将一个基因替换为了一个标记基因，或通过其它表型进行筛选步骤：构建敲除框转化筛选鉴定第14页，课件共41页，创作于2023年2月8.1构建敲除框酶切连接：将待敲除片段及两端序列PCR后插入T载体中，选择合适的酶切位点，插入标记基因；将待敲除片段的左端和右端及抗性基因分别进行PCR，得到三段引物，用酶连法顺序连接至载体中；融合PCR；将待敲除片段的左端和右端及抗性基因分别进行PCR，得到三段引物，用酶连法顺序连接至载体中；长引物PCR；在引物末端设计长的同源片段，扩增得到标记基因后，直接用于转化。第15页，课件共41页，创作于2023年2月8.2转化化学转化法：原核微生物：氯化钙法、Inoue法等；酵母：锂盐法。电转化法：原核微生物：甘露醇法；酵母：山梨醇法；锂盐+DTT预处理+山梨醇法。基因枪法：将待转化的核酸片段包被于金属颗粒上，直接用于转化。脂质体法：用于动植物细胞的转化，偶尔用于酵母转化。第16页，课件共41页，创作于2023年2月8.3筛选根据抗生素抗性：原核微生物：氨苄抗性、卡那抗性等；酵母：G418、Zeocin、博莱霉素等。根据营养缺陷型回复：酵母：尿嘧啶、亮氨酸、腺嘌呤缺陷型回复。第17页，课件共41页，创作于2023年2月8.4鉴定提取基因组，进行PCR验证；基因功能缺失的表型验证；Southern杂交；Northern杂交；Western杂交。第18页，课件共41页，创作于2023年2月基因敲除实例-以LEU2作为筛选标记敲除酿酒酵母ACS2基因乙酰辅酶A(acetyl-CoA)是细胞内重要的辅因子，参与微生物细胞众多的生化反应。细胞内的乙酰辅酶A合成酶有两个同工酶，分别由ACS1和ACS2编码，在酿酒酵母中的主要合成途径为丙酮酸脱氢酶支路。如下图所示。第19页，课件共41页，创作于2023年2月2.将经过PCR反应所得的目标片断连接到T载体(蓝白斑筛选)使用引物设计软件PrimerPremier5.0

设计ACS2基因合成所需的PCR反应的引物。ACS2-F：5’-GCgaattcATGACAATCAAGGAACATA-3’ACS2-R：5’-GCaagcttTTATTTCTTTTTTTGAGAGA-3’从NCBI上得到的ACS1/2基因序列第20页，课件共41页，创作于2023年2月3.使用引物设计软件PrimerPremier5.0设计KlLEU2引物，并以pUG73作为模板进行PCR反应。(该引物两端均带有NcoI的酶切位点和若干保护碱基)4.使用NcoI限制性内切酶分别处理步骤2，3所得的目标产物，并进行连接反应。将KlLEU2片断连接到T载体上。第21页，课件共41页，创作于2023年2月5.以连接后所得的T载体作为模板，ACS2-F，ACS2-R为引物进行PCR反应，得到如下图所示长片断。6.将该长片断电转化至酿酒酵母中，用亮氨酸缺陷型回复作为标记筛选阳性克隆子。7.将不含有亮氨酸的培养基上长出的单菌落提基因组进行PCR（以ACS2-F，ACS2-R为引物）。进一步验证排除假阳性。第22页，课件共41页，创作于2023年2月9.过量表达整合表达常见于毕赤酵母(Pichiapastoris)中，利用pPIC系列整合载体，将要表达的片段整合到染色体上；在酿酒酵母中，也可以利用YIP系列整合载体(载体名称可能有所不同)，将要表达的片段整合到染色体上特点：整合的转化子同源重组效率较低不易筛选，可能对基因组产生潜在的破坏作用，单拷贝，稳定。质粒载体表达：用于各种真核和原核表达体系中，将待表达的片段置于合适的启动子和终止子之间，如果有必要的话，还需要加上适当的信号肽序列(如分泌表达，或定位于亚细胞结构内时)，连接到合适的表达载体中。再将整个载体转入宿主细胞中。特点：容易操作，高拷贝，无选择压力时不稳定。第23页，课件共41页，创作于2023年2月基因过量表达实例-酿酒酵母ACS1/2基因的过量表达利用PrimerPremier5.0设计ACS1/2基因的引物，并添加图上所示的酶切为点，经过PCR，酶切，连接，转化后得到表达载体第24页，课件共41页，创作于2023年2月表达载体导入受体细胞进行目标基因的过量表达3D(ura)pY263D(ura)pY26-ACS13D(ura)pY26-ACS2经过电击或者化学转化后，酿酒酵母在不含有URA3的平板上长出单菌落。第25页，课件共41页，创作于2023年2月随着发酵的进行细胞内乙酰辅酶A含量的变化情况第26页，课件共41页，创作于2023年2月10.质粒的结构质粒载体，通常分为两类：克隆载体表达载体按在目标菌株中的拷贝数分类：高拷贝质粒载体——几乎所有的克隆载体都是高拷贝的，易于提取和进行后续基因操作，如：

pUC系列载体，pBlueScript系列载体，pY系列载体；低拷贝质粒载体——为了防止拷贝数过高对宿主细菌产生不利影响，一般是表达载体，如：

pET系列载体，pRS系列载体。第27页，课件共41页，创作于2023年2月用于基因工程操作的质粒一般具有以下特性：复制起点

如果是穿梭载体(Shuttlevector)，还需要具有不同菌株的复制起点，如酵母穿梭载体中的2m片段和相应菌株的CEN-ARS片段。抗性标记多克隆位点(MCS,Multi-CloningSite)为了表达位于其上的基因，一般还需要具有：合适的启动子合适的信号肽序列(可选)相应的终止子为了便于对连接上的基因进行鉴定，通常还有测序引物结合位点：T7，M3……第28页，课件共41页，创作于2023年2月抗性基因抗性基因复制起点早期的pBR322载体，整个载体用酶连形成的第29页，课件共41页，创作于2023年2月多克隆位点(用于连接外源基因)复制起点基于pBR322的pUC19载体，可以用蓝白斑筛选抗性基因用于蓝白斑筛选的lacZ基因测序引物结合位点第30页，课件共41页，创作于2023年2月关于蓝白斑筛选pUC19和其它pUC系列载体(包括Takara的T载体)上的lacZ基因经过改造，引入了一系列酶切位点。当酶切位点中未插入其它基因时，加入半乳糖类似物IPTG后，lacZ基因开始表达，并可以催化X-Gal，使菌落呈蓝色；当酶切位点插入其它基因时，lacZ基因被破坏，菌落为白色。第31页，课件共41页，创作于2023年2月多克隆位点(用于连接外源基因)复制起点大肠杆菌中的表达载体pET-28a(+)抗性基因HisTag第32页，课件共41页，创作于2023年2月关于HisTagHisTag是一串编码组氨酸的序列，使得表达的产物的末端带有6个组氨酸，这6个组氨酸可以形成特定的构向，可以用于：目标蛋白的快速纯化：可以用镍柱进行快速分离；简单的Western杂交：可以与HisTag抗体进行杂交，进行快速的鉴定或定量。类似的还有Thrombin，HemagglutininTag等，常见于各种表达载体中，方便表达产物蛋白的纯化。第33页，课件共41页，创作于2023年2月启动子氨苄抗性多克隆位点酵母中的筛选标记2mum片段酵母中的复制起点终止子酿酒酵母中的表达载体pYX212第34页，课件共41页，创作于2023年2月大肠杆菌中常用的启动子组成型启动子：T7……一般是来源于噬菌体的强启动子，不需要诱导即可实现高效表达缺点：无法实现可控表达诱导型启动子：lacZ……半乳糖或IPTG诱导缺点：葡萄糖抑制，半乳糖和IPTG价格昂贵，无法用于实际生产和大规模的实验热诱导启动子冷诱导启动子……第35页，课件共41页，创作于2023年2月酵母中常用的启动子组成型启动子：TPI，GPD，TEF，ACT……一般是各种中心代谢途径中的酶或细胞骨架的启动子，不需要诱导即可实现高效表达缺点：无法实现可控表达诱导型启动子：GAL1，GAL4，GAL10……半乳糖诱导缺点：葡萄糖抑制，半乳糖价格昂贵，无法用于实际生产和大规模的实验METn系列启动子半胱氨酸抑制CUPn启动子铜诱导第36页，课件共41页，创作于2023年2月11.常用软件VectorNTIAdvance11序列管理与质粒作图PrimerPremier5.0+Oligo6.71引物设计与质量评估QuantityOne凝胶电泳图像处理AdobeIllustratorCS4+AdobePhotoshopCS4电泳图像后处理与示意图以上软件均须熟练掌握！第37页，课件共41页，创作于2023年2月12.常用网址NCBI