毕赤酵母发酵产S

毕赤酵母发酵产S-腺苷蛋氨酸的甘油-甲醇混合流加策略肖安风;许海琴;倪辉;杜希萍;蔡慧农【摘要】在毕赤酵母发酵生产S-腺苷蛋氨酸(SAM)的诱导阶段，以不同甘油-甲醇比例的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养結果表明以10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基进行诱导培养时最有利于SAM的表达,SAM产量达6.09g/L,比0%甘油含量条件下的SAM产量提高了20.4%.对诱导方式进行优化，先以100%甲醇诱导24h撚后再连续流加10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基,SAM产量可达7.94g/L,在此基础上,进一步改进诱导方式,SAM产量得到进一步的提高，达到9.80g/L.%MixedcarbonsourcesculturemediumwithdifferentratioofglyceroltomethanolwasevaluatedintheS-ade-nosyl-L-methionine(SAM)fermentativeproductionbyrecombinantPichiapastoris.Whenthesupplementmixedmediumcontained10%(w/v)glycerol,SAMproductionreached6.09g/L,whichwas20.4%higherthantheproductionoffeeding0%glycerolcontainedmedium.Onthatbasis,twosetsofglycerol-methanolmixed-feedingstrategywereperformedatthe7LfermentortoimproveSAMproduction.When100%methanolwasfedintobioreactorfor24hbefore10%(w/v)glycerolcontentofmixedmediumwasputintouse,SAMproductionwasraisedto7.94g/L.Whendifferentglycerolcontentofmixedmediumwasfedintobioreactoratfivedifferentsectionsduringthemethanolinductionphase,SAMproductionreachedthehighest9.80g/L.期刊名称】《激光生物学报》年(卷),期】2012(021)005【总页数】8页(P446-452,457)【关键词】毕赤酵母S腺苷蛋氨酸;发酵;混合流加策略【作者】肖安风;许海琴;倪辉;杜希萍;蔡慧农【作者单位】集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校食品微生物与酶工程研究中心,福建,厦门,361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校食品微生物与酶工程研究中心,福建,厦门,361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校食品微生物与酶工程研究中心,福建,厦门,361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;福建省高校食品微生物与酶工程研究中心,福建,厦门,361021;厦门市食品与生物工程技术研究中心,福建,厦门,361021【正文语种】中文【中图分类】Q815S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)是生物体内重要的代谢中间物质，参与了人体内多种代谢途径的关键生化反应，具有转甲基、转氨丙基和转硫基作用［1-3］。临床研究证明，SAM对肝病、关节炎、空泡脊髓炎、抑郁症及痴呆症等有着明显的疗效，在医学上具有广泛的应用价值。上世纪中叶，国外开始对SAM进行研究制备。80年代，在欧洲SAM已经作为处方药物得到广泛使用。1999年，美国FDA批准其上市，SAM在美国成为最畅销营养保健药品之一。国内对SAM的研究起步较晚，因SAM发酵水平偏低、分离纯化成本高及其不稳定性，到目前为止国内仍未能工业化生产SAM，用于治疗的SAM全部依赖于进口，价格昂贵。微生物发酵法是工业化生产SAM的主要途径，目前用于产SAM的微生物有霉菌、细菌、酵母等。Shiozaki等［4］筛选分离出一株清酒酵母K-6，在含10%蔗糖，1.8%尿素，1%酵母膏，0.75-1.5%L-蛋氨酸的培养基中添加CaCI2、生物素及双甘氨肽后，在10L发酵罐中SAM的产量达到了10.8g/L。李东阳等［5］将酿酒酵母的SAM合成酶基因导入毕赤酵母中，在含甲醇及L-蛋氨酸的培养基中发酵5d后，胞内SAM产量比原始菌株提高了30倍。王杰鹏等［6］在5L发酵罐上对产SAM酿酒酵母SAM0801菌株的L-蛋氨酸补加策略进行考察，优化后SAM最高产量达到14.48g/L。重组毕赤酵母的发酵过程可分为两个阶段-甘油生长阶段和甲醇诱导阶段:酵母细胞首先利用甘油作为碳源快速生长，当生物量达到较高密度后，开始流加甲醇，诱导外源蛋白表达。在甲醇诱导阶段，因甲醇对细胞具有一定的毒害作用，在发酵过程中会造成细胞活力减弱而不利于外源蛋白的表达［7］°D'anjou等［8］报道在毕赤酵母发酵生产海乌鸦抗冻蛋白的甲醇诱导阶段，流加甲醇的过程补加适量的甘油，能够增强细胞活力，进而有利于发酵过程积累较多的外源蛋白，但是，当发酵液中存在甘油时，又会抑制甲醇氧化酶(AOX)基因的表达，导致外源蛋白表达减少。根据这种情况，本实验在甲醇诱导阶段，分别流加不同甘油含量的甘油-甲醇(w/v)混合培养基，考察其对重组毕赤酵母发酵生产SAM的影响，进而根据实验结果，对流加方式进行优化，以提高发酵过程的SAM产量。产SAM毕赤酵母GS115菌JMU0907，集美大学生物工程学院发酵工程研究室保藏。种子培养基:葡萄糖20g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L。发酵培养基:85%(w/v)H3PO426.7mL/L,CaSO40.93g/L,K2SO418.20g/L,KOH4.13g/L，MgSO4・7H2O14.90g/L，甘油40g/L，ANTIFOAM204(Sigma)0.33mL/L，氨水调pH至5.0。1x105Pa湿热灭菌30min，再加入PTM1微量元素溶液4.4mL/L。PTM1微量元素溶液:CuSO4・5H2O6.0g/L,Nal0.08g/L,MnSO4・H2O3.0g/L,Na2MoO4・2H2O0.2g/L,HBO30.02g/L,CoCI2・6H2O0.914g/L,ZnCI220.0g/L,FeSO4・7H2O65.0g/L，生物素0.2g/L,H2SO45.0mL/L。无菌过滤，4°C避光保存。甘油流加培养基：50%(w/v)甘油,1x105Pa湿热灭菌30min，再加入12mL/LPTM1。甘油-甲醇混合培养基(％,w/v):称取一定质量的甘油，用甲醇定容至1L，再加入12mLPTM1微量元素溶液。在YPD平板上挑取单菌落于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,28C,250r/min培养24h。按10%接种量将培养好的种子液接入装有4L发酵培养基的7L发酵罐中，控制发酵温度30C,通气量为3mL/min，发酵pH5.0,溶氧40%以上进行培养。当甘油耗尽后,溶氧快速上升,开始限制性连续补加甘油流加培养基，使细胞生长至一定密度。甘油限制性流加结束后，DO迅速回升，维持细胞在碳源饥饿状态30min,保证酵母菌体内残留的甘油耗尽。最后,以3mL/(L・h)的流速连续流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合培养基至发酵结束。生物量的测定:菌液以蒸馏水适当稀释后于波长600nm测定OD600值。L-蛋氨酸的测定:发酵液3500r/min离心15min，取上清液用超纯水稀释10倍后，13000r/min离心15min，利用HPLC测定L-蛋氨酸含量［9］。SAM的测定［9,10］:取1mL发酵液12000r/min离心3min，弃上清，加入2mL1.5moI/L高氯酸，反应2h,加入2mL1.25moI/L氨水,4C静置过夜。样品12000r/min离心5min后，利用HPLC测定SAM含量。5mL发酵液8000r/min冷冻离心10min，弃上清。蒸馏水洗涤三次。于-20工冻结，冻结菌体称重后加入等量预冷石英砂研磨破壁，，然后加少量的0.1mol/LTris・HCI缓冲液(pH8.0)萃取，12000r/min离心5min，取上清液并加入等体积的2xSDS加样缓冲液，混匀后沸水浴5min,12000r/min离心5min，取上清液进行SDS(分离胶浓度12%，浓缩胶浓度5%)[11]。D'anjou[8]报道毕赤酵母发酵生产海乌鸦抗冻蛋白的甲醇诱导阶段，添加适当比例的甘油，可以提高外源蛋白的表达量，这是因为适量添加甘油能增强酵母细胞的代谢，从而提高外源蛋白的表达。同时，在重组毕赤酵母发酵生产SAM的甲醇诱导阶段，甲醇一方面作为碳源用于细胞的生长、代谢，另一方面，甲醇又作为诱导物，诱导SAM合成酶的产生，催化ATP和L-蛋氨酸合成SAM。细胞生长需要消耗大量的能量，发酵液中甲醇浓度过低，细胞处于饥饿状态，没有足够的能量用于菌体的生长代谢及SAM的合成，SAM的产量偏低;增加发酵液中的甲醇浓度，可以提供充足的能量供细胞利用，此外，适当增加甲醇浓度，也可以提高AOX基因的活性，使SAM合成酶的表达量增加，进而增加SAM的合成;但是，发酵液中甲醇浓度过高，又会抑制细胞的生长、减弱细胞的代谢甚至导致细胞的死亡[12],因此，过高的甲醇浓度又会导致SAM的产量下降。针对这种情况，在甲醇诱导阶段，分别流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合培养基，考察培养基中甘油含量对SAM发酵生产的影响。重组毕赤酵母发酵过程生物量的变化如图1所示。在以甘油为碳源的生长阶段及甘油限制性流加阶段(0~24h),酵母细胞利用甘油作为碳源快速生长，24h后进入甲醇诱导阶段，分别流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合培养基。可以发现，流加0%甘油含量的甘油-甲醇混合培养基，酵母细胞的生长速率最慢，这是因为毕赤酵母GS115菌株是甲醇缓慢利用型菌株，在单独流加甲醇时，甲醇的利用速率极低，菌体生长极为缓慢。从图1中可以看出，随着流加培养基中甘油含量增加，生物量也有所增加，其中流加30%甘油含量的甘油-甲醇混合培养基所获得的生物量最大。但是，继续增加培养基中甘油的含量，生物量又出现下降的趋势，这是因为发酵液中甘油含量过高，甘油被不完全代谢容易产生乙醇［13］，乙醇积累对酵母细胞的生长产生了抑制。在SAM合成酶的催化下,L-蛋氨酸与ATP反应生成SAM。检测发酵过程L-蛋氨酸的含量变化，得到图2。可以发现，在以甘油为碳源的生长阶段，培养基中约40%的L-蛋氨酸被快速利用于生长;在甲醇诱导开始的24h内，L-蛋氨酸的消耗速率仍然较快，随着发酵时间的进行，L-蛋氨酸的消耗速率减缓，至96h后，培养基中的L-蛋氨酸浓度维持在一个相对稳定的水平。检测毕赤酵母发酵过程的SAM含量变化，结果如图3所示。由图3可知，不同条件下毕赤酵母发酵生产SAM过程中，SAM的积累主要分为3个阶段:在以甘油为碳源的生长阶段，酵母细胞内SAM的含量接近于0g/L;甲醇诱导开始后的24h内(24h~48h),SAM在胞内快速积累，在此期间，随着甘油含量的增大，SAM的生产速率反而下降，其原因甘油不完全代谢产生的乙醇抑制了AOX启动子的表达［13］,导致SAM合成酶表达量减少致使SAM合成速率降低;甲醇诱导24h后(48~144h),SAM在胞内以较慢的速率积累，此时的SAM增长趋势呈现与前—阶段完全不同的情况。碳源中不添加甘油，SAM产量不再增加，而在碳源中添加甘油，SAM生产速率随甘油添加量的增加而呈现增加的趋势。根据图3的试验结果，计算不同时间段的SAM生产速率变化，结果如表1所示。从表中可以看出发酵48h后各时间段的SAM生产速率明显低于24h~48h的生产速率。在24h~48h之间，SAM合成速率与甘油-甲醇混合培养基中甘油含量成反比例关系，随着甘油含量的增大，SAM的生产速率随之减小，由此可见，甘油的含量越高，对SAM合成的抑制越明显。至48h之后，流加0%甘油-甲醇与1%甘油甲醇混合培养基条件下，酵母细胞内的sam含量处于一个平衡状态，胞内SAM的浓度几乎不再积累。随着混合流加培养基中甘油含量的增大，促进酵母细胞以甘油作为碳源生长，增强细胞活力，促进代谢，有利于胞内sAM的积累因此，发酵48h之后，以较大甘油比例流加，SAM的含量均呈现较大幅度的增长，至发酵结束，10%甘油-甲醇条件下的SAM最高产量达到6.09g/L，比0%甘油-甲醇的产量提高了20.4%。由于在诱导阶段酵母密度较高，流加过量的碳源会导致酵母细胞的摄氧速率大于发酵罐的传氧速率，引起代谢溢流，因此30%、50%甘油-甲醇混合培养基诱导下的各时间段SAM生产速率均处于较低水平。图4为发酵144h时流加不同甘油-甲醇比例样品的凝胶电泳结果图，利用QuantityOne软件，对所获得的电泳图进行分析，其中SAM合成酶的光密度值列于表2。从表2中可以得知，在甲醇诱导过程流加1%或10%甘油含量的甘油-甲醇混合培养基，其胞内SAM合成酶浓度高于流加100%甲醇的对照组。推断其原因，在培养基中添加适量甘油，有利于细胞生长，获得较高的生物量（见图1），因此胞内SAM合成酶含量相应增加。继续增加流加碳源中的甘油含量，SAM合成酶含量下降。在甲醇酵母（毕赤酵母或汉逊酵母）发酵过程中，甲醇的代谢受甲醇氧化酶的调控，而甲醇氧化酶基因的表达受到阻遏/解阻遏机制的调控，高浓度的甘油及代谢产生的乙醇会阻遏基因的表达，而甲醇及低浓度的甘油能解除阻遏，使得相关酶得到有效表达［14，15］。与发酵过程SAM含量变化曲线（图3）相比较，可以发现，表2中流加1%甘油含量混合碳源所收获的SAM合成酶与流加10%甘油含量混合碳源基本相等，而所收获的SAM产量却明显低于后者。这是因为SAM在酵母细胞中是由ATP及L-Met在SAM合成酶的催化下合成的，在SAM合成酶含量一定的条件下，添加适宜浓度的甘油能够增强细胞代谢，增加细胞内ATP的含量，从而增大SAM的产量。因此，虽然以1%、10%甘油-甲醇进行诱导下的SAM合成酶相对含量相近，但是10%甘油-甲醇诱导的SAM产量明显高于1%甘油-甲醇诱导的SAM产量。根据表1的结果，可以知道，在不同的时间段，流加不同甘油含量的甘油-甲醇混合培养基，其SAM生产速率不同:在发酵24~48h之间，流加100%甲醇所获得的SAM生产速率最大;48h之后，以10%甘油-甲醇混合培养基进行诱导时，SAM生产速率最大。因此，设计试验，在毕赤酵母发酵生产SAM的甲醇诱导阶段，先以100%甲醇诱导24h(24~48h)，然后再连续流加10%甘油含量的甘油-甲醇混合培养基直至发酵结束(48~144h)。所得发酵曲线如图5所示。实验结果表明，该诱导方法比在发酵24h后直接以10%甘油-甲醇混合培养基进行诱导的SAM产量提高了30.4%，最高产量达到7.94g/L。从图1中可以看出，流加固定甘油含量的甘油-甲醇混合培养基时，自48h开始，生物量及SAM含量的增长速率均出现减缓现象。采用新的培养方式，生物量及SAM浓度在48~72h阶段还有一个较明显的增长。计算不同发酵时间段SAM的生产速率，得到表3。与表1相比，在发酵48-72h,改以10%甘油-甲醇混合培养基进行诱导时SAM生产速率为0.1249g/(L・h),明显高于以固定甘油含量的混合碳源进行诱导的SAM生产速率。由此可见，在毕赤酵母发酵生产SAM的诱导过程中改变混合碳源中的甘油含量有利于SAM的积累。由图5和表3可知，发酵72h之后，酵母细胞基本上不再积累SAM，这表明在该培养方式下，酵母细胞的SAM合成及分解已经达到平衡:一方面细胞代谢产生的ATP有限，无法合成更多的SAM，另一方面甲醇对细胞活力具有一定的影响，导致SAM分解速率增加。根据这种情况，结合上述结果，设计了新的补料方式，具体见表4。由表4所示，在甲醇诱导的不同阶段，分别以不同甘油含量的混合碳源进行诱导培养，以获得更高的SAM产量。此外，考虑到发酵过程的细胞活力损失，在发酵在96~108h之间补加甘油流加培养基（50%甘油/水），使细胞活力增加，提高胞内ATP的产生量，有利于SAM的生成。改进补料方式下的发酵结果如图6所示。在改进的补料方式下，SAM的产量得到进一步的增加。在发酵72h时，SAM产量已经达到了7.54g/L，与同期的0%-10%补料方式基本一致，而且，在发酵72h至96h之间，改进诱导方式下的SAM生产速率仍然以较快的速率增加，至96h达到9.40g/L。96~108h之间，补加甘油流加培养基（50%甘油/水），因此SAM含量略微下降，不过108h之后，以100%甲醇进行诱导，SAM产量又呈现增加的趋势，至发酵144h,SAM产量达到9.80g/L。计算改进诱导方式下不同发酵时间段的SAM生产速率，得到表5。相比表3和表5中可以看出，在发酵的前72h，两种补料方式下的SAM合成速率没有较大差异。但是改进方式在72-96h,108-144h两个阶段，SAM仍保持一定的生长速率，相比之下，前一种改变甘油添加量的补料方式，发酵自72h后，SAM合成速率接近于0。对两种诱导方式发酵至144h的酵母细胞进行破碎，破碎液进行SDS凝胶电泳及酶反应，SDS凝胶电泳结果采用Quantityone软件进行分析，考察两种诱导方式下其SAM合成酶相对含量差异。结果如图7及表6所示。其中图7为SAM合成酶凝胶电泳图，A泳道为改进补料方式细胞破碎液电泳泳道，B泳道为0%—10%甘油含量补料方式细胞破碎液电泳泳道，C泳道为marker。SAM合成酶相对酶含量考察结果表明，两种不同诱导方式在发酵至144h时，单位体积发酵液中的SAM合成酶含量没有显著差异。但是发酵至144h,0%-10%甘油含量诱导方式的SAM产量为7.94g/L，改进诱导方式的SAM产量为9.80g/L，明显高于前者。从图6中可知，改进诱导方式发酵至72h,SAM产量达7.54g/L;在72h将甘油-甲醇混合培养基中甘油的比例提升至10%后，SAM生产速率相对于48-72h有明显的提高。这可能是因为在发酵至72h时，1%的甘油已不足以提供足够的碳源，以致细胞代谢减弱，ATP的合成减少，进而影响SAM的产量。在7L发酵罐上，利用重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷蛋氨酸(SAM)。首先考察碳源中甘油-甲醇混合比例对SAM产量的影响，当流加10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基时，SAM产量最高，达到6.09g/L，是流加100%甲醇条件下SAM产量的1.2倍。在此基础上，对甘油-甲醇混合培养基的流加方式进行优化，先以100%甲醇诱导24h，然后再连续流加10%(w/v)甘油含量的甘油-甲醇混合培养基，SAM产量达到7.94g/L。进一步改进诱导方式，在甲醇诱导的不同阶段，分别以不同甘油含量的碳源进行诱导培养，SAM产量可达到9.80g/L。*通讯作者:蔡慧农(1957－)，男，汉族，福建厦门人，集美大学教授，主要从事遗传育种和发酵工程研究。(电话*************;(电子邮箱)***********.cn【相关文献】GRILLOMA，COLOMBATTOS.S-adenosylmethionineanditsproducts[J].AminoAcids，2008，34(2):187-193.BOTTIGLIERIT.S-adenosyl-L-methionine(SAMe):fromthebenchtothebedside-molecularbasisofapleiotrophicmolecule[J].AmJClinNutr，2002，76(suppl):1151S-1157S.[3]余志良，杨晟，蔡谨，等.S-腺苷甲硫氨酸研究进展[J].中国医药工业杂志，2003,34(1):49-52.YUZhiliang，YANGSheng，CAIJin，etal.DevelopmentinS-adenosyl-L-methionine[J].ChineseJournalofPharmaceuticals，2003，34(1):49-52.[4]SHIOZAKIS，SHIMIZUS，YAMADAH.ProductionofS-adenosyl-L-methioninebySaccharomycessake[J].JBiotechnol，1986，4(6):345-354.[5]李东阳，于健，田露，等•利用重组Pichiapastoris生产腺苷甲硫氨酸[J]•生物工程学报，2002，18(3):295-299.LIDongyang，YUJian，TIANLu，etal.ProductionofSAMbyrecombinantPichiapastoris[J].ChineseJournalofBiotechnology，2002，18(3):295-299.[6]王杰鹏，谭天伟•发酵法生产S-腺苷蛋氨酸前体蛋氨酸补加策略[J]•生物工程学报，2008,24(10):1824-1827.WANGJiepeng，TANTianwei.Pre-L-methioninefeedingstrategyforS-adenosyl-L-methioninefermentativeproduction[J].ChineseJournalofBiotechnology，2008，24(10):1824-1827.[7]XIAOA，ZHOUX，ZHOUL，etal.ImprovementofcellviabilityandhirudinproductionbyascorbicacidinPichiapastorisfermentation[J].ApplMcirobiolBiotechnol，2006，72(4):837-844.[8]D'ANJOU，MC，DAUGULISAJ.ArationalapproachtoimprovingproductivityinrecombinantPichiapastorisfermentation[J].BiotechnolBioeng，2001，72(1):1-11.[9]朱志钢，储炬，胡晓清，等•重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸培养条件优化[J]•工业微生物，2006,36(3):5-8.ZHUZhigang,CHUJu,HUXiaoqing,etal.OptimizationoncultureconditionsforproducingS-adenosyl-L-methioninebyrecombinantPichiapastoris[J].IndustrialMicrobiology，2006，36(3):5-8.[10]邓娟娟•利用重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸工艺的研究[D]•武汉:华中农业大学，2006.DENGJuanjuan.StudyontheproductionofS-adenosylmethioninebyrecombinantPichiapastoris[D].Wuhan:HuazhongAgriculturalUniversity，2006.[11]戚薇，铁瑛.SAM合成酶基因的克隆及在酿酒酵母中的高效表达[J]•天津科技大学学报，2008，23(4):31-34，39.QIWe