分子生物学的生物合成转录

分子生物学的生物合成转录1第1页，课件共60页，创作于2023年2月转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNA此过程把DNA的碱基序列转抄成RNA。5′3′3′5′编码链3′5′模板链2第2页，课件共60页，创作于2023年2月复制和转录的区别3第3页，课件共60页，创作于2023年2月参与转录的物质原料:NTP模板:DNA酶:RNA聚合酶RNApolymerase,RNA-pol其他蛋白质因子bAOCH2POPP~~ATPOCH2POPP~~UUTPGOCH2POPP~~GTPCOCH2POPP~~CTP4第4页，课件共60页，创作于2023年2月第一节模板和酶TemplatesandEnzymes5第5页，课件共60页，创作于2023年2月一、转录模板DNA分子上能转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作信息链、转录链、有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为非转录链、反义链或Crick链。6第6页，课件共60页，创作于2023年2月不对称转录

(asymmetrictranscription)转录对DNA链的选择性称为不对称转录。有两方面的含义：在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非永远在同一条单链上。7第7页，课件共60页，创作于2023年2月二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶目前研究比较透彻的是E.coli的RNA聚合酶。其它原核生物的RNA聚合酶在结构、组成、功能上都与E.coli的RNA聚合酶相似。所有原核生物RNA聚合酶都受利福平或利福霉素抑制。8第8页，课件共60页，创作于2023年2月真核生物的RNA聚合酶转录产物对鹅膏蕈碱反应耐受极敏感中度敏感ⅢⅡⅠ45SrRNAHnRNA5S-rRNAtRNAsnRNARNA聚合酶9第9页，课件共60页，创作于2023年2月（二）真核生物的RNA聚合酶已发现三种RNA聚合酶分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，专一性地转录不同的基因，生成不同的产物i。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶的特异性抑制剂，但敏感性不同。10第10页，课件共60页，创作于2023年2月三、模板上酶的辨认、结合原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。结构基因调控序列操纵子：转录单位或转录区段启动子RNA-PolRNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。11第11页，课件共60页，创作于2023年2月对启动子的研究方法

RNA-Pol保护法1）分离某段基因并与纯RNA-pol混合；2）加入核酸外切酶（胰DNA酶）水解DNA；3）分离被RNA聚合酶结合而未被水解的基因片段；4）测定并分析保护区（40-60bp）的碱基序列；12第12页，课件共60页，创作于2023年2月RNA-pol的移动TTGACAAACTGTTATAATATATTARNA-pol-40-35-30-25-20-15-10-50+5+10+15+20+25启动子保守序列开始转录转录起始点13第13页，课件共60页，创作于2023年2月真核生物启动子保守序列顺式作用元件-GCGC---CAAT---TATA结构基因转录起始TATA盒CAAT盒GC盒增强子14第14页，课件共60页，创作于2023年2月第二节转录过程TheProcessofTranscription15第15页，课件共60页，创作于2023年2月一、原核生物的转录过程（一）转录起始就是RNA-Pol结合到DNA模板上的起始区域，DNA双链局部解开，一条链作模板面加入第一个、第二个NTP，RNA-Pol催化形成第一个磷酸二酯键。转录起始复合物形成。RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH316第16页，课件共60页，创作于2023年2月（二）转录延长亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi17第17页，课件共60页，创作于2023年2月1、转录空泡RNA-Pol（核心酶）-DNA-RNA形成的转录复合物RNA聚合酶可以覆盖40bp以上长度的DNA转录解链范围小于20bp杂化双链长度约12bpNMP逐个加入遇到模板为A时加入的是U不是TRNA-Pol向下游移动时RNA分子的5′pppG······的结构仍然保留18第18页，课件共60页，创作于2023年2月35¢DNARNA聚合酶核糖体RNA2、原核生物转录过程中的羽毛状现象19第19页，课件共60页，创作于2023年2月（三）转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类1、依赖Rho(ρ)因子的转录终止2、非依赖Rho因子的转录终止20第20页，课件共60页，创作于2023年2月2.非依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构。举例：大肠杆菌核蛋白体蛋白基因大肠杆菌色氨酸操纵子21第21页，课件共60页，创作于2023年2月二、真核生物的转录起始（一）转录起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。22第22页，课件共60页，创作于2023年2月3.转录起始前复合物

(pre-initiationcomplex,PIC)真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。23第23页，课件共60页，创作于2023年2月4.模板理论(piecingtheory)拼板理论认为：一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。24第24页，课件共60页，创作于2023年2月（二）转录延长RNA-pol前移处处都遇上核小体，二者大小差别不大。转录延长过程中可以观察到核小体移位（仅见于试管内转录）和解聚现象。真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。25第25页，课件共60页，创作于2023年2月（三）真核生物的转录终止真核生物转录终止和转录后修饰密切相关。1．真核生物DNA上有转录终止的信号，称为转录终止的修饰点。已知真核生物DNA读码框架的3′端均含富含AT的序列（如AATAAA或ATTAAA等）；相隔0-30bp后又出现TTTT顺序（通常是3-5个T）；该结构可能与转录终止及3′端加polyA有关。2．转录越过转录修饰点后的RNA在修饰点被切断，随即“加尾”、“戴帽”。余下RNA继续转录，但产物很快被酶水解。26第26页，课件共60页，创作于2023年2月真核生物的转录终止及加尾修饰3′processing5′mGpppG－－－AAUAAA－Poly（A）Nuclease3′－－AATAAA－－GTGTGTG5′－－PAUSE－－3′－－5′3′－－5′－－－－3′－－5′Release5′－－AAUAAA－－GUGUGUGRNA-polⅡ转录终止修饰点RNA-polⅡ27第27页，课件共60页，创作于2023年2月第三节真核生物的转录后修饰Post-transcriptionalModification28第28页，课件共60页，创作于2023年2月几种主要的修饰方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修饰(modification)4.

添加(addition)29第29页，课件共60页，创作于2023年2月一、真核生物mRNA的转录后加工（一）首、尾的修饰5端形成帽子结构(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)30第30页，课件共60页，创作于2023年2月PolyA的形成mRNA5′m7GpppGAAUAAA3′H2O核苷酸片段核酸内切酶nATPnPPiPoly(A)聚合酶mRNA5′m7GpppGAAUAAAOH3′mRNA5′m7GpppGAAUAAAAAA(A)nOH3′31第31页，课件共60页，创作于2023年2月（二）mRNA的剪接1.hnRNA和snRNA核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclearRNA,hnRNA)mRNA来自hnRNA（去掉中间片段）snRNA(smallnuclearRNA)核内的蛋白质小分子核糖核酸蛋白体（并接体,splicesome）snRNA32第32页，课件共60页，创作于2023年2月mRNA来自hnRNA核酸序列分析证明：mRNA是去掉大部分中间片段的hnRNA。核酸杂交实验证明：hnRNA与DNA模板链可以完全配对；而mRNA与DNA模板链杂交则出现部分配对的局部双链区域和中间相当多的鼓泡状突出的单链区段。因此提出真核生物基因的断裂性的概念。33第33页，课件共60页，创作于2023年2月核酸杂交实验3′5′模板DNAhnRNA3′5′全长互补3′5′模板DNA成熟mRNA3′5′局部互补鼓泡状突出34第34页，课件共60页，创作于2023年2月核酸杂交实验鸡卵清蛋白成熟mRNA（虚线部分）与基因DNA（实线部分）分子杂交后电镜所见。7个内含子（鼓泡状突出部分）将8个外显子分开。成熟mRNA模板DNA35第35页，课件共60页，创作于2023年2月断裂基因(splitegene)真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。编码区A、B、C、DABCD非编码区36第36页，课件共60页，创作于2023年2月2.外显子(exon)和内含子(intron)外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。37第37页，课件共60页，创作于2023年2月胰岛素基因、转录产物、翻译产物胰岛素基因（编码链）5′3′intronintronSBCCAPre成熟mRNASBCAPre转录后加工产物前胰岛素原翻译产物翻译后加工修饰产物信号肽前导序列B亚基C肽A亚基SBCAPre胰岛素SSSSBA38第38页，课件共60页，创作于2023年2月断裂基因及其转录、转录后修饰

注：涂黑处为前导顺序（L）和外显子（1、2、3、4、5、6、7）7.7kb卵清蛋白基因hnRNAGpppGAAA···AAA首尾修饰的hnRNAGpppGAAA···AAA剪接中的套索RNAL1276543GpppGAAA···AAA胞浆mRNA39第39页，课件共60页，创作于2023年2月3.内含子的分类根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA；III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子；IV：是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。40第40页，课件共60页，创作于2023年2月4.mRNA的剪接除去hnRNA中的内含子，将外显子连接为成熟的RNA的过程称为剪接。剪接的模式：内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子互相靠近而利于剪接，称为套索RNA（lariatRNA）内含子结构特点：大多数内含子都以5′-GU…开始，而其末端则为…AG-OH-3′。5′-GU……AG-OH-3′称为剪接接口（splicingjunction）或边界序列。剪接后，GU或AG不一定被剪除。41第41页，课件共60页，创作于2023年2月snRNA（smallnuclearRNA）核内小RNA由百余个至300个核苷酸组成，分子中以U含量最丰富，故以U作分类命名。现已发现有snRNAU1、U2、U3、U4、U5、U6等类别。小分子核糖核蛋白体（smallnuclearribonucleoprotein，snRNP）：由snRNA和核内蛋白质组成，作为RNA剪接的场所。剪接体或并接体（splicesome）：由snRNP与hnRNA结合形成套索并拉近上、下游外显子距离的复合体。剪接体本身有剪接酶活性。剪接体可以结合在hnRNA内含子区段并使内含子弯曲、两断接近，利于剪接。42第42页，课件共60页，创作于2023年2月剪接过程（A.Klessig模式）（1）首先snRNP与hnRNA结合：snRNP上的U1-snRNA和U2-snRNA分别靠碱基互补关系去辨认、结合hnRNA上内含子的5′-GU和AG-OH-3′末端。U4、U5、U6加入形成完整的剪接体。2个外显子之间的内含子因为与剪接体的结合而弯曲，使两个末端互相靠近形成套索，上下游的外显子互相靠近，有利于进行转酯反应。内含子靠近3′端有一个甲基化的嘌呤核苷酸：如3mG，是形成套索的关键所在。43第43页，课件共60页，创作于2023年2月U1-snRNAUC-CAUACAUApppmGU1-snRNPU2-snRNAAUGAUGUpppmGU2-snRNPsnRNP与hnRNA的结合内含子可以弯成套索UACUACA-AGAG-GUAUGU外显子1外显子2hnRNA5′3′44第44页，课件共60页，创作于2023年2月②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U545第45页，课件共60页，创作于2023年2月（2）mRNA的剪接过程除掉内含子、连接外显子：两次转酯反应（transesterification）UpAGpUU-OH（pppG、ppG）pG-OH（辅酶）pAGpUUpUpAG-OH转酯反应1（亲电子攻击）转酯反应2pGpG外显子1外显子2内含子46第46页，课件共60页，创作于2023年2月肝脏apoB100（分子量为500000）5.mRNA的编辑(mRNAediting)•RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differentialRNAprocessing)。人类apoB基因mRNA（14500个核苷酸）mRNA编辑肠道细胞apoB48（分子量为240000）47第47页，课件共60页，创作于2023年2月二、tRNA前体的后加工（一）tRNA前体的后加工的内容1．切除多余的顺序（1）含单个tRNA的tRNA前体：在5′端和3′端各有一段多余顺序；（2）含二个tRNA的tRNA前体：5′端和3′端有长短不一的多余顺序，在两个tRNA之间还有数目不等的核苷酸隔开。（3）有的真核tRNA前体的反密码子环区含有一个居间顺序。48第48页，课件共60页，创作于2023年2月RNA-polⅢ转录的基因及其初级产物TloopDHU-loopCAC虚线部分要在转录后加工剪除同时在3′末端加上“—CCA”TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCC49第49页，课件共60页，创作于2023年2月二、tRNA的转录后加工TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNATGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNAtRNA前体RNApolⅢRNApolⅢtRNA前体50第50页，课件共60页，创作于2023年2月tRNA的剪接是酶促反应切除以下实验可以推论和证实tRNA的剪接是需要酶的：成熟的tRNA能竞争性地抑制tRNA的剪接，这是酶促反应的特征之一。tRNA的成熟过程对温度敏感。内含子的核酸内切酶由tRNA基因内含子编码反应需要ATP供能RNaseP及内切酶tRNA核苷酸转移酶及连接酶ATPA-OHCC51第51页，课件共60页，创作于2023年2月2．各种稀有碱基的生成（1）甲基化：如tRNA甲基转移酶催化的反应：嘌呤→甲基嘌呤。（2）还原反应：U→DHU。（3）核苷内转位反应：尿嘧啶核苷→假尿嘧啶核苷（ψ：psai）。（4）脱氨基反应：A→I。3．在3′-末端出去