分子生物学实验原理与常见问题解答

分子生物学实验原理与常见问题解答第1页，课件共52页，创作于2023年2月RNA提取原理与注意事项PCR原理与常见问题Real-timePCR介绍内容第2页，课件共52页，创作于2023年2月商品化提取试剂盒原理：

异硫氰酸胍（GIT）-酚法

GIT与十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；一定条件下（各家试剂条件不同），RNA不溶于乙醇，而DNA和蛋白质溶于乙醇溶液，通过滤柱时，RNA挂柱，DNA和蛋白质溶于滤液；在逐步洗脱的过程中，RNA不断被纯化；最后用水洗脱。第3页，课件共52页，创作于2023年2月

杜绝外源酶的污染：严格戴好帽子，口罩，手套。实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。RNA提取的注意事项（外界环境中多含Rnase，且RNA极不稳定）RNasefreeDNasefree第4页，课件共52页，创作于2023年2月

阻止内源酶的活性：

选择合适的匀浆方法。选择合适的裂解液。控制好样品的起始量。第5页，课件共52页，创作于2023年2月RNA提取原理与注意事项PCR原理与常见问题Real-timePCR第6页，课件共52页，创作于2023年2月PCR技术的基本原理

模板DNA的变性：93℃-95℃左右，模板DNA与引物的退火(复性)：Ta=Tm-3~5℃

引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性变性--退火--延伸三个步骤

第7页，课件共52页，创作于2023年2月引物的复性温度

通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T）复性温度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合第8页，课件共52页，创作于2023年2月1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第9页，课件共52页，创作于2023年2月模板DNA95℃第10页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物第11页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第12页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始第13页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第14页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束第15页，课件共52页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数

第16页，课件共52页，创作于2023年2月标准的PCR反应体系（100ul体系）10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul第17页，课件共52页，创作于2023年2月PCR反应五要素模板（template）引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）

dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）Mg2+（magnesium）第18页，课件共52页，创作于2023年2月（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。第19页，课件共52页，创作于2023年2月（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶

0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。第20页，课件共52页，创作于2023年2月（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。第21页，课件共52页，创作于2023年2月（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。第22页，课件共52页，创作于2023年2月EB染色原理：

EB插入DNA碱基对之间的结合第23页，课件共52页，创作于2023年2月PCR常见问题无扩增产物非特异性扩增拖尾假阳性第24页，课件共52页，创作于2023年2月

无扩增产物现象：阳对照有条带，而样品则无M样品A样品B阳性对照第25页，课件共52页，创作于2023年2月纯度：含有抑制物浓度：含量低质量：RNA被降解操作：体系配制有误，模板加入有误

原因纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板RNA加大模板的用量重新提取RNA，并做好无Rnase前处理重新配置扩增体系，重新PCR对策第26页，课件共52页，创作于2023年2月

非特异性扩增

现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。第27页，课件共52页，创作于2023年2月引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多

原因重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数

对策第28页，课件共52页，创作于2023年2月

现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

M12第29页，课件共52页，创作于2023年2月模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多

原因纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数

对策第30页，课件共52页，创作于2023年2月靶序列或扩增产物的交叉污染

原因开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外更换试剂、耗材试剂分装，贮存适当。更换实验室和所有试剂耗材。假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物对策第31页，课件共52页，创作于2023年2月PCR中应注意的事项（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分第32页，课件共52页，创作于2023年2月Real-timePCR技术介绍第33页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR定义

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法第34页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析第35页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析第36页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理-----------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件第37页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99

真正的信号:荧光信号超过域值第38页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value第39页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定，误差大；Ct值则极具重现性起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；终点量经过PCR放大，并非研究所期望的数据第40页，课件共52页，创作于2023年2月非特异性荧光标记：

1、SYBRGreenⅠ特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon实时荧光定量PCR的几种方法介绍

第41页，课件共52页，创作于2023年2月－SYBRGreenⅠ法第42页，课件共52页，创作于2023年2月SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBRGreen第43页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation第44页，课件共52页，创作于2023年2月实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度第45页，课件共52页，创作于2023年2月--TaqMan法第46页，课件共52页，创作于2023年2月与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quen