谷胱甘肽响应的可激活磁共振成像纳米探针的制备研究

下载后可任意编辑，修改下载后可任意编辑，修改页 1绪论1.1研究背景近年来，肿瘤的发生越来越多，且发病年龄越来越年轻化。然而，肿瘤很难在早期得到及时诊断和治疗，因此，恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的常见病，多发病，早期特异性诊断可提高患者生存率，改善生活质量[1]。由于传统影像诊断方法主要针对实质性肿瘤，此时患者已经处于临床中晚期，故治疗效果差，预后较差。所以，恶性肿瘤仍然是威胁人类健康与寿命的一大关键因素。因此，在临床上找到一种有效的肿瘤检查方式与诊断方法并进行良恶性判定具有十分重要的意义。既往有大量的研究专注于寻找特异性的肿瘤血清标志物，应用于肿瘤的早期诊断[2]。研究发现，肿瘤组织中谷胱甘肽（GSH）含量明显高于肿瘤旁组织，在人乳腺癌细胞MCF-7中，谷胱甘肽的浓度为（6.29士0.67）nmol/106。吴琛珩等对人消化道肿瘤组织的检测结果也揭示，肿瘤组织内还原性谷胱甘肽和辅酶Ⅰ（GSH、NADPH）的含量显著高于相应的癌旁组织，提示肿瘤细胞中确有GSH的高表达[3]。随着分子生物学和医学影像学的飞速发展，近年来产生了一门新兴的交叉学科--分子影像学。分子影像学是指运用影像学的手段，在组织、细胞和亚细胞水平显示活体状态下某些特定分子的变化，对生物学行为进行定性和定量的研究，为疾病过程在体监测、基因治疗、在体示踪、药物在体疗效评测和功能分子在体活动规律研究提供新技术。分子影像学在疾病早期诊断、提供疾病发展重要信息和评价治疗效果方面具有诱人的潜能，具有无创、实时、在体、特异、精细显像等优点[4-6]。所以，分子影像技术可望为疾病的研究和临床“早早期”诊断、治疗提供基因分子水平信息，而在分子影像学成像技术中，靶向性和高亲和性分子探针的制备起着关键作用[7-8]。磁共振成像是利用生物体不同组织在磁共振过程中产生的具有不同特征的电磁波信号成像技术，是上世纪80年代以来医学影像学发展的最新成就之—[9-10]。磁共振成像技术也因为其无创伤性、无辐射损伤、非侵入性、并具有多序列、多参数（不同组织与磁共振有关的特征参数如质子密度、纵向弛豫时间、横向弛豫时间、弥散系数等都可以作为成像参数）、任意平面成像、较高的密度分辨率等优点[11]广泛的应用于临床，已经成为临床诊断中最常用的影像检查手段之一[12]。但是随着医学技术的飞速的发展和人们生活水平的日益提高，常规的磁共振检查已经不能满足临床诊断的要求，人们对磁共振成像的特异性、精确性、敏感性提出了更高的要求。为了实现对微小病变及隐匿病变的早发现、早诊断、早治疗，学者纷纷投入到提高疾病诊断准确性的成像方法的研究。虽然单一的磁共振成像设备已经对脂肪、软组织等低密度组织具有的成像效果，但它仍然不可以实现对全身任意组织的扫描成像并提供有诊断价值的图像。通过磁共振和其他成像设备的结合（例如磁共振和PET的结合形成PETMRI）[13-14]，多通道探测器可视化的开发，不仅可以从解剖水平观察病变，而且可以从分子代谢水平研究病变组织的代谢情况从而定性诊断疾病。但是这样的组合仍然存在许多固有的问题，如因多个成像器件空间分辨率及时间分辨率的图像定位导致生物样品的差异所造成的困难[15]。另一解决方案为：磁共振对比剂。磁共振对比剂的应用更是极大地拓展了磁共振成像技术的临床适用范围。磁共振造影剂是能够缩短组织在外磁场作用下的共振时间、增大对比信号的差异、提高成像对比度和清晰度的一类诊断试剂[16]。磁共振对比增强的基本原理是通过改变内、外界弛豫效应和磁化率效应间接地改变组织的信号强度，从而达到提高不同组织间信号差异的目的。磁共振对比剂的应用，可以增强正常组织与病变组织之间的信号对比，使微小病变更加突出，使得微小病变与隐匿病变的早发现、早诊断成为可能。它能有效改变生物体内组织中局部的水质子弛豫速率，缩短水分子中质子的弛豫时间，准确地检测出正常组织与患病部位之间的差异，从而最终显示生物体内各器官或组织的功能状态。磁共振对比剂要应用于人体，除了要满足药物的基本要求，具有生物适应性、水溶性好和良好的稳定性外，还应具有以下特性：（1）靶向性：即对比剂进入人体后能选择性聚集，在靶组织富集并停留一段时间，使靶区域被观测核的弛豫速率比其他正常组织部位有更大的增强，以达到增加正常组织与病变组织的对比度。（2）细胞毒性小：对比剂中游离的稀土金属离子和配体毒性较强，而其配合物毒性较低。稀土金属离子的置换效应是毒副作用的主要影响因素，所以MRI对比剂在体内的有效期中应为稳定配合物。（3）高的弛豫率：对比剂对水质子的弛豫能力影响其在体内磁共振成像的效果。弛豫能力越强，活体成像效果就越好。（4）在体内有适当的存留时间：既为成像提供必要的时间，又易于从体内排出，不会在体内积累。按增强类型不同，磁共振对比剂可以分为阳性对比剂和阴性对比剂。阳性对比剂一般是指可以增强信号强度的顺磁性物质，例如轧剂、氧化锰等。阳性对比剂以缩短T1弛豫时间为主（在T1加权成像中增加信号的强度），表现在图像上增强区显示信号增强。在T1加权像中，由公式I=KN(H)(1-e-TR/T1)可知，如果组织器官的T1短，则MR信号强度强，图像变亮；如果组织器官T1长，则MR信号强度弱，图像变暗。目前应用最广泛的磁共振阳性对比剂即Gd-DTPA，中文名为二乙三胺五醋酸钆或钆喷酸葡甲胺盐，商品名为马根维显（Magnevist）[17-18]。Gd-DTPA是一种顺磁性物质，它的增强原理为：Gd3+具有7个不成对电子，其不成对电子与质子一样为偶极子，具有磁距。电子质量很轻，但其磁距约为质子的657倍。在无顺磁性物质的情况下，组织的T1弛豫是由质子之间的偶极子-偶极子相互作用，形成局部磁场波动所引起的。在有不成对电子的顺磁性物质存在时，由于电子的磁化率约为质子的657倍，从而产生局部巨大磁场波动。此时，大部分电子的运动频率与Larmor频率相近，而使邻近质子的T1弛豫时间缩短，即形成所谓质子偶极子-电子偶极子之间的偶极子-偶极子相互作用，引起所谓质子磁豫增强，其结果造成T1弛豫时间缩短。在Gd-DTPA浓度较低时，由于机体组织的T1弛豫时间较长，故对比剂对机体组织的T1弛豫时间影响较大。然而，随着Gd-DTPA浓度增加，T2缩短效应渐趋明显。Gd-DTPA通过改变周围氢核的磁性起作用，具有亲水性、相对分子质量小的特点，注入血管后迅速向周围组织间隙分布，由肾脏排泄，对各系统的病变都有诊断与鉴别诊断的价值。虽然Gd-DTPA被广泛的应用于临床[19-22]，但存在很多的缺陷。为了降低Gd3+本身的毒性，人们采取制备钆离子螯合物的方式来提高对比剂的生物相容性。但螯合物的形成会降低对比剂的对比度，因为与水合钆离子的8-9个位点来说，钆离子螯合物中可与水质子交换的配位点的数目只有1-2个。另一方面，绝大多数的钆对比剂的血液循环时间较短，对组织和细胞缺少选择性，难于表面功能化也限制了其进一步应用。同时，钆离子螯合物中的Gd3+一旦去螯合或者与人体中存在的其他离子，如Zn2+等，交换螯合后被释放有可能会带来潜在的毒性。而且有报道指出钆基对比剂会对生物体肾小管造成直接损害，引起肾细胞纤维化[23]。且绝大多数钆类小分子对比剂都是离子型造影剂，体内渗透压较高，在体内存留时间较短，易经肾脏代谢后迅速排出，不具有组织或器官的选择性，常常迅速渗透到细胞外液间隙而产生背景影像强化。因此，如何开发具有靶向性、高弛豫效率、使用安全的对比剂是MRI研究的重点和主要发展方向之一。随着科学技术的进步，关于纳米粒子的研究越来越成为众多学者关注的焦点，许多纳米材料的磁共振阳性对比剂应运而生[24]，例如：PEG-Gd2O3、BSA-Gd2O3[25-26]等。由于纳米粒子的特性，更易于进行表面功能化与功能组装，提高其靶向性。使对比剂不仅具可以辅助诊断，而且可以具有治疗作用。阴性对比剂通常是超顺磁性的纳米粒子（例如氧化铁）及高浓度的顺磁性物质。阴性对比剂以缩短T2弛豫时间为主（在T2加权成像中降低信号强度），呈暗或黑色低信号。在T2加权像中，由公式I=KN(H)e-TE/T2可知，如果组织器官T2长，则MR信号强度强，图像变亮；如果组织器官T2短，则MR信号强度弱，图像变暗。超顺磁性氧化铁（SPIO：SuperparamagneticIronOxide）是近年来迅速发展的一种纳米材料[27]，由于其特殊的化学结构，在较弱的外磁场中就可产生巨大的磁性，而外磁场撤销后无剩磁。它的作用原理为：SPIO颗粒直径40~400m，表面用葡聚糖包裹。由于血液中直径在30~5000nm的颗粒主要经网状内皮系统清除，因而静脉注射后该类对比剂进入肝脏及脾脏的网状内皮细胞(RES：Reticuloendothelialsystem)，产生短T2效应，在肝脏枯否细胞可摄取对比剂颗粒。由于正常肝脏存在枯否细胞，而肿瘤内一般无或少含无枯否细胞，因此对比剂能增加肿瘤与肝实质间的对比，从而提高肝脏肿瘤的检出率，对鉴别肿瘤是否肝细胞来源也有较大价值。目前有多种网状内皮细胞性MR对比剂已经商品化，如AMI-25和Feridex（菲立磁）[28]等。SPIO纳米粒子由不同的外层材料包裹三氧化二铁或四氧化三铁形成，其颗粒小，穿透力强，弛豫率为同条件下钆离子的7-10倍，在很低浓度条件下即可在MRI形成对比[29]。更重要的是，SPIO纳米粒子通过表面化学修饰可以进一步结合特殊的抗体、氨基酸、蛋白或酶而具有吸收特异性[30]。但是，SPIO纳米粒子被细胞吸收后聚集于溶酶体中，在溶酶体低的pH环境里，被分解成为铁粒子，可用于合成血红蛋白，因而在体内具有低的毒性[31]。1.2课题的提出综上所述，单一模态的磁共振对比剂，虽然在常见疾病的诊断上已经发挥出巨大的作用，但是对于一些微小隐匿病变仍然无法提供具有高诊断准确性的MRI图像。而且单模态对比剂毒性大，在体内会产生非特异性聚集，使非病变组织产生增强的MR信号，从而导致高的非特异性背景和低目标背景比。因此，单模态的磁共振对比剂正面临巨大的挑战。基于此，我们提出将阴性超顺磁性纳米粒子氧化铁对比剂和阳性PEG-Gd2O3对比剂相结合的可激活磁共振对比剂。可激活对比剂具有高弛豫率、细胞毒性小、靶向性好、特异性强、敏感性高等特点。目前，关于可激活对比剂的报道并不多，因此可激活对比剂成为众多学者研究的重点。SPIO和PEG-Gd2O3表面都含有羧基（CO）,通过表面含有两个氨基（NH）的胱胺相连接，当没有肿瘤细胞存在时，由于SPIO产生的磁场对PEG-Gd2O3的磁共振信号有淬灭作用，在磁共振T1图像上没黑色或灰黑色，当有肿瘤细胞存在时，由于肿瘤细胞中谷胱甘肽（GSH）含量比正常细胞高出许多，谷胱甘肽将连接SPIO和PEG-Gd2O3的双硫键打开，在磁共振T1图像上表现为明亮或白色信号。从而实现对肿瘤的靶向作用。提高诊断的准确信和特异性。1.3论文结构和各章节安排论文第一章简要介绍了本实验的研究背景，且阐述了本文研究内容的提出。论文第二章对阳性对比剂PEG-Gd2O3和阴性对比剂SPIO以及“连接物”胱胺的合成方法、性质进行了详细的阐述和介绍。论文第三章讨论了可激活对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3的制备过程及优化。论文第四章进行了可激活对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3的细胞毒性研究，利用MTT法考察其生物相容性。论文第五章：总结与展望。2材料合成2.1四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子合成2.1.1引言氧化铁(通常指磁铁矿Fe3O4或者磁赤铁矿γ－Fe2O3)纳米粒子，应用于磁共振成像已有20多年的历史了。超顺磁性氧化铁(SPIO，粒径小于30nm)纳米粒子网状内皮组织吸收，在肝、脾、骨髓等组织会器官处富集会大大缩短T2弛豫时间，SPIO作为T2造影剂的典型代表，已经临床多年，如FeridexIVResovistLumirem进行肝脏造影、追踪成像等[32-36]。近年来，随着纳米技术的飞速发展，四氧化三铁纳米颗粒作为功能材料，在磁记录材料、特殊催化剂原料、磁流体的基本材料和磁性颜料、药物等方面显示出许多特殊功能，有关纳米磁性Fe3O4的制备方法及性质的研究也受到广泛关注。SPIO纳米粒子的合成方法有许多种，常用的有共沉淀法、微乳液法、超声空气法等[37-38]。其中，共沉淀法是制备SPIO纳米粒子最常规的方法，也是较为简单和技术成熟的方法，它是将二价铁盐和三价铁盐溶液按一定比例混合，将碱性沉淀剂快速加入至上述混合溶液中，搅拌、反应一段时间经洗涤、干燥，可得SPIO粉末。SPIO为符合氧化物，是由相应的氢氧化物转化而来，因此该反应的理论摩尔比为Fe2+：Fe3+：OH=1.00：2.00：8.00，但是由于实反应中二价铁离子易氧化成三价铁离子，所以实际反应中二价铁离子应当适当过量[39]。本文在制备Fe3O4的基础上，又对已经制备的纳米探针进行了TEM扫描，磁共振信号响应，傅里叶红外光谱分析以检验制备的纳米粒子是否符合作为对比剂的要求。2.1.2实验试剂及器材（1）所用材料：试剂：二氯化铁FeCl2（上海山海工学团实验二厂）；三氯化铁FeCl3（沪试，国药集团化学试剂有限公司）；氨水（沪试，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬三钠（沪试，国药集团化学试剂有限公司）溴化钾。材料：EP管、移液器枪头、一次性吸管（美国AXYGEN公司）（2）所用器材：智能恒温定时磁力搅拌器，型号：B12-3（上海司乐仪器有限公司）；超纯水仪（美国，Milli-QRefereme）；舒美超声波清洗器，型号：KQ218（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平，（上海精密科学仪器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德国Eppendorf公司）；电热恒温干燥箱，（上海跃进医疗器械厂）；精密增力电动搅拌器，型号：JJ-1（常州国华电器有限公司）；红外光谱仪，型号：NEXUS870（美国Nicolet公司）；透射电子显微镜TECNAIG2，（美国FEI公司）；3.0Tsignal全身磁共振成像设备，（美国GE公司）。2.1.3实验步骤（1）称取0.19882gFeCl2溶于10mL蒸馏水，称取0.54058gFeCl3溶于10mL蒸馏水，并用超声仪将之混合均匀；（2）用一次性吸管将混合均匀的两溶液加入三口烧瓶中，30度水浴加热；（3）在机械搅拌作用下，用恒压滴液漏斗慢慢将3.5mL浓氨加入；（4）氨水加完后，继续剧烈搅拌30min，在滴加氨水的过程中，可以看到溶液的颜色由橘红色逐渐变黑色；（5）用磁铁将Fe3O4纳米粒子吸出，用双蒸水纯化，直到PH=7.0；（6）在60摄氏度下真空干燥24小时，研磨得到Fe3O4纳米粒子。2.1.4透射电子显微镜（TEM：Transmissionelectronmicroscope）扫描将SPIO纳米粒子用双蒸水配制成100μg/mL的纳米溶液，超声使其分散均匀，各取1滴置于铜网上，室温晾干，于透射电子显微镜下观察形态并拍照。SPIO纳米粒子的TEM下的形态如图2.2。 图2.1Fe3O4被磁铁吸引图2.2Fe3O4的TEM图像从图2.1，我们可以看出，制备的Fe3O4被磁铁吸引，具有较强的磁性。从图2.2可以看出，Fe3O4整体呈类圆形分布，大小均匀的灰色颗粒，较分散，有少许团聚现象，团聚的纳米粒子呈黑色。随机选择20个纳米粒子进行测量，用NanoMeasurer软件，计算平均粒径，可得到下图2.3的粒径分布。图2.3Fe3O4纳米粒子粒径分布图从图2.3可以看出，随机选择的20个纳米粒子的尺寸最大值为16.96nm，最小值为12.08nm，用NanoMeasurer软件，计算平均粒径为14.05nm，在纳米材料的粒径范围之内。2.1.5ICP-MS制样将500μL0.24mg/mL的Fe3O4溶液，与500μL的浓硝酸（HNO3）混合，并在80℃环境下加热30min。再取6mL的浓硝酸与78mL的水配成84mL5%的稀硝酸。在四氧化三铁和浓硝酸的混合溶液中加入25mL稀硝酸。所得样品送到南京大学分析测试中心用ICP-MS仪器检测0.24mg/mL的Fe3O4溶液中Fe3+浓度。2.1.6MR扫描（1）不同浓度Fe3O4纳米粒子溶液的制备首先称取1.92mg制备好的Fe3O4、3.84mg柠檬酸三钠，将两者加入8mL的蒸馏水，充分混合均匀，得到0.24mg/mL的Fe3O4NPs。取0μL、1.25μL、2.5μL、3.75μL、5μL、6.25μL、7.5μL、8.75μL、10μL、11.25μL、12.5μL的0.24mg/mL的Fe3O4NPs分别溶于300μL、298.75μL、297.5μL、296.25μL、295μL、293.75μL、292.5μL、291.25μL、290μL、288.75μL、287.5μL的蒸馏水中，用超声混合均匀，得到浓度分别为0mmol/L、0.005mmol/L、0.01mmol/L、0.016mmol/L、0.021mmol/L、0.032mmol/L、0.037mmol/L、0.043mmol/L、0.048mmol/L、0.053mmol/L的Fe3O4纳米粒子溶液。（2）MR扫描条件设置采用头颅8通道相控线圈，进行T1加权成像（T2-weightedimaging,T2WI）扫描。MR扫描参数为：重复时间（Repetitiontime,TR）4500ms,回波时间（Echotime,TE）90.7ms，矩阵384×224，视野（Fieldofview,FOV）14cm×14cm，层厚2.0mm，层距0.2mm。（3）不同浓度Fe3O4纳米粒子的磁共振信号响应3.0TMRI扫描样品的T2值如下表2.1。表2.1不同浓度Fe3O4纳米粒子的磁共振信号响应序号123457891011浓度0mM0.005mM0.01mM0.016mM0.021mM0.032mM0.037mM0.043mM0.048mM0.053mMT2550.59389.48278.59216.47180.50142.62119.91119.55105.4290.625根据表2.1，用Origin软件做成下图2.4。图2.4Fe3O4NPsT2弛豫率测定从图2.4我们看出，制备的Fe3O4纳米粒子的弛豫率为164.5，与文献中描述的相当。且制备的Fe3O4纳米粒子的T2弛豫率与浓度呈梯度关系。表明制备的Fe3O4纳米粒子具有优良的MRI对比增强能力，可以用作对比剂使用。2.1.7傅里叶变换红外光谱分析取少量（约10μL）Fe3O4纳米粒子和一定量的溴化钾，置于电热恒温干燥箱中60℃干燥10分钟之后取出，研磨使之混合均匀，压成一薄片进行测量。波长范围为500-4000cm-1。红外光谱分析的结果用Origin作图，可得下图2.5。图2.5Fe3O4红外光谱图图2.5中显示Fe3O4在3441cm-1处有一较强的吸收峰，其代表OH的伸缩振动峰，而在1591cm-1处的吸收峰是C=O的伸缩振动峰，两者皆是Fe3O4表面羧基官能团的红外特征吸收峰，说明Fe3O4表面存在羧基。2.2PEG-Gd2O3合成2.2.1引言MRI是临床诊断及临床前研究的领先技术，它成像无组织器官深度局限性，无电离辐射，可多参数多平面成像。但是，由于缺乏高弛豫率、低毒或无毒、体内循环时间最优的理想对比剂，磁共振在诊断具有特定的分子标志物的病变方面及监测药物治疗效应方面受到了极大的限制。目前临床使用的MRI对比剂Gd-DTPA弛豫率低、体内毒性强，所以随着磁共振应用范围的不断增加，临床对特异性的磁共振对比剂的需求越来越强烈。近年来，分子影像学取得了巨大的发展，靶向传递能够增加对比增强的有效性、减少剂量和毒性，是一种能满足影像诊断需求的良好策略。因此，靶向特异性的磁共振对比剂的研发是十分必要的。目前，已有研究证明氧化钆纳米颗粒具有比目前广泛使用的钆螯合剂更高的弛豫效能。基于氧化钆纳米颗粒可以用作T1对比剂，增强信号强度，这一研究吸引了众多学者的关注，引起了广泛的研究兴趣。氧化钆纳米颗粒不仅可以增强对比效果，而且提供与修饰物连接的可能。在本文章中，选择研究较成熟的PEG-Gd2O3作为阳性对比剂，讨论了PEG-Gd2O3的制备及对MRI信号响应做了评价[40]。2.2.2实验试剂及器材（1）所用材料：试剂：硝酸钆（北京百灵威科技有限公司）；聚乙二醇二羧酸poly(ethyleneglycol)。材料：EP管、移液器枪头、一次性吸管（美国AXYGEN公司）（2）所用器材：超纯水仪（美国，Milli-QRefereme）；智能恒温磁力搅拌器（上海予华仪器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德国Eppendorf公司）；智能恒温定时磁力搅拌器，型号：B12-3（上海司乐仪器有限公司）；电子天平，（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温干燥箱，（上海跃进医疗器械厂）；4℃冰箱，（中国海尔集团）；红外光谱仪，型号：NEXUS870（美国Nicolet公司）；3.0Tsignal全身磁共振成像设备，（美国GE公司）。2.2.3透析袋前处理透析袋前处理的基本方法：（1）把透析袋剪成适当长度（10-20cm）的小段；（2）在1000mL的烧杯中加入2%（W/V）的碳酸氢钠和1mmol/LEDTA.2Na（PH=8）（称取10g碳酸氢钠和186.6mgEDTA.2Na溶于500mL蒸馏水，混合均匀），加入透析袋煮沸10分钟；（3）用蒸馏水彻底清洗透析袋；（4）在1000mL的烧杯中加入1mmol/LEDTA.2Na（PH=8）（称取186.6mgEDTA.2Na溶于500mL蒸馏水，混合均匀），在第（3）步中的透析袋加入进去，煮沸10分钟；（5）冷却后，置于50%的酒精中，放于4℃冰箱，确保透析袋始终浸没在溶液内。2.2.4实验步骤（1）称取0.4062g硝酸钆加入三口烧瓶中，注意不要沾到烧瓶壁上；（2）在三口烧瓶中滴加10mL聚乙二醇二羧酸poly(ethyleneglycol)，混合均匀；（3）用恒温磁力搅拌器加热到90-100℃，得到澄清溶液；（4）升温到140℃加热1小时；（5）继续升温到180℃加热4小时；（6）将冷却的溶液加入到之前准备好的透析袋中，在2000mL的大烧杯中透析3天，每8小时换一次水（蒸馏水）；（7）将透析好的PEG-Gd2O3装入50mL的离心管中，放入4℃冰箱备用。2.2.5MR扫描根据文献，氧化钆纳米材料的弛豫率比目前临床使用的Gd-DTPA高，为了讨论Gd-DTPA和PEG-Gd2O3的弛豫率高低，分别把PEG-Gd2O3和Gd-DTPA配成10个不同浓度进行3.0TMRI扫描。（1）不同浓度Gd-DTPA溶液的制备首先取10个1.5mL的EP管，分别编号为1—10。在10个EP管中,分别加入360μLGd-DTPA、240μL蒸馏水，240μLGd-DTPA、360μL蒸馏水，120μLGd-DTPA、480μL蒸馏水，60μLGd-DTPA、540μL蒸馏水，48μLGd-DTPA、552μL蒸馏水，36μLGd-DTPA、564μL蒸馏水，24μLGd-DTPA、576μL蒸馏水，12μLGd-DTPA、588μL蒸馏水，6μLGd-DTPA、594μL蒸馏水，1.2μLGd-DTPA、598.8μL蒸馏水，总量均为600μL。分别制成浓度为3mmol/L、2mmol/L、1mmol/L、0.5mmol/L、0.4mmol/L、0.3mmol/L、0.2mmol/L、0.1mmol/L、0.05mmol/L、0.01mmol/L的Gd-DTPA溶液。（2）不同浓度PEG-Gd2O3溶液的制备配制不同浓度PEG-Gd2O3：首先取10个1.5mL的EP管，分别编号为1—10。在10个EP管中,分别加入600μLPEG-Gd2O3，300μLPEG-Gd2O3、300μL蒸馏水，240μLPEG-Gd2O3、360μL蒸馏水，180μLPEG-Gd2O3、420μL蒸馏水，120μLPEG-Gd2O3、480μL蒸馏水，60μLPEG-Gd2O3、540μL蒸馏水，30μLPEG-Gd2O3、570μL蒸馏水，12μLPEG-Gd2O3、588μL蒸馏水，6μLPEG-Gd2O3、594μL蒸馏水，3μLPEG-Gd2O3、597μL蒸馏水，总量均为600μL。分别制成浓度为0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.12mmol/L、0.09mmol/L、0.06mmol/L、0.03mmol/L、0.015mmol/L、6μmol/L、3μmol/L、1.5μmol/L的PEG-Gd2O3溶液。将不同浓度的Gd-DTPA和不同浓度的PEG-Gd2O3进行MRI扫描，MRI扫描条件设置同2.1.5。所得的T1弛豫时间用Origin软件做成下图2.6。图2.6不同浓度PEG-Gd2O3及Gd-DTPA的磁共振响应从图2.6可以看出两点：首先不同浓度PEG-Gd2O3的T1弛豫时间的回归方程为：y=0.48056+29.00451x，弛豫率为：29.00451。不同浓度Gd-DTPA的T1弛豫时间的回归方程为：y=0.4892+4.20993x，弛豫率为4.20993。也就是说，PEG-Gd2O3的T1弛豫率是目前使用的Gd-DTPAT1弛豫率的七倍多。弛豫率越高。成像效果越好。为了得到同样具有诊断价值的图像，所需PEG-Gd2O3的浓度仅为Gd-DTPA的七分之一，所需对比剂的量大大减少，降低了细胞毒性，减少对人体的伤害。其次PEG-Gd2O3磁共振信号按浓度呈现梯度性响应并且其弛豫率达到29.00451，表明制备的PEG-Gd2O3纳米粒子具有优良的MRI对比增强能力，可以用作对比剂使用。2.2.6傅里叶变换红外光谱分析取少量（约10μL）PEG-Gd2O3和一定量的溴化钾，置于电热恒温干燥箱中60℃干燥10分钟之后取出，研磨使之混合均匀，压成一薄片进行测量，波长范围为500-4000cm-1。红外光谱分析的结果用Origin作图，可得下图2.7。图2.7PEG-Gd2O3红外光谱图图2.7显示PEG-Gd2O3在1616cm-1处的吸收峰是C=O的伸缩振动峰,PEG链上的C-O-C和C-H的伸缩振动峰分别出现在1100cm-1和2867cm-1处，1451cm-1、1349cm-1、1250cm-1处的吸收峰是由于CH2的伸缩振动导致的。PEG-Gd2O3制备成功。2.3胱胺合成2.3.1引言胱胺的化学结构很特殊，其表面含有有个氨基（NH）和一个双硫键，四氧化三铁和氧化钆表面都含有羧基（CO），通过胱胺表面的两个氨基可以把四氧化三铁和氧化钆连在胱胺的两边。中间通过双硫键连接，由于双硫键的特殊结构，其可以被在肿瘤组织中高表达的谷胱甘肽及强还原物质打开，在体内只能被谷胱甘肽打开，所以可以用于人体用于对肿瘤的特异性诊断。当双硫键没有被打开时，由于四氧化三铁产生的强磁场对氧化钆的淬灭作用，MRIT1为黑色或灰色，但当双硫键被GSH打开时，T1信号变明亮，则提示肿瘤组织的存在。其作用原理如下图2.8。图2.8可激活MRI纳米探针作用原理图2.3.2实验试剂及器材（1）所用材料：试剂：半胱胺酸（北京百灵威科技有限公司）；氢氧化钠（沪试，国药集团化学试剂有限公司）；二氯甲烷（沪试，国药集团化学试剂有限公司）。材料：EP管、移液器枪头、一次性吸管（美国AXYGEN公司）（2）所用器材：超纯水仪（美国，Milli-QRefereme）；智能恒温定时磁力搅拌器，型号：B12-3（上海司乐仪器有限公司）；10μL、20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德国Eppendorf公司）；旋转蒸发器，型号：RE-52AA，（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（III）循环水式真空泵，（巩义市予华仪器有限责任公司）；舒美超声波清洗器，型号：KQ218（昆山市超声仪器有限公司）；电子天平，（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温干燥箱，（上海跃进医疗器械厂）；4℃冰箱，（中国海尔集团）。2.3.3实验步骤（1）称取1.7g半胱胺酸和0.88g氢氧化钠，溶于300mL蒸馏水，超声使之混合均匀；（2）常温下磁力搅拌30分钟得到透明液体；（3）按照1:1的比例取（2）中制好的液体和二氯甲烷在分液漏斗中进行粹取（混匀、放气连续三次），粹取完的液体分成两层（一层水相，一层油相），收集下面的二氯甲烷在30℃的条件下旋转蒸发；（4）重复（3）直到所有（2）制好的液体粹取蒸发完，得到淡黄色透明液体，即胱胺。2.4讨论本实验利用化学沉淀法制备Fe3O4纳米粒子，并通过透射电镜、MRI响应、傅里叶红外光谱分析对制备的Fe3O4纳米粒子的特性进行表征；通过MRI响应、傅里叶红外光谱分析对制备的PEG-Gd2O3纳米粒子的特性进行表征；通过傅里叶红外光谱分析对制备的胱胺进行表征。实验数据表明Fe3O4纳米粒子、PEG-Gd2O3纳米粒子以及“连接物”胱胺制备成功，可以用于后续实验。3可激活MRI纳米探针Fe3O4-SS-Gd2O3的制备为了确定可激活对比剂中四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子和氧化钆（PEG-Gd2O3）的最佳浓度，需要四氧化三铁和氧化钆的浓度进行优化处理。用控制单一变量的方法，首先确定一个氧化钆的量，通过改变四氧化三铁的浓度，配制溶液进行MRI扫描，得到四氧化三铁的最佳浓度；然后再同理按照上述方法，确定最佳氧化钆和谷胱甘肽的浓度。3.1Fe3O4-SS-Gd2O3的傅里叶变换红外光谱分析为了验证Fe3O4表面及PEG-Gd2O3表面的羧基与胱胺上的氨基共价结合成Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针，我们将稀释的Fe3O4-COOH、PEG-Gd2O3、Gd2O3-cystamine和Gd2O3-SS-Fe3O4纳米探针进行傅里叶变换红外光谱分析。红外光谱分析的结果用Origin作图，可得下图3.1。图3.1纳米探针组装的红外光谱图图3.1中显示PEG-Gd2O3与胱胺反应后，出现游离的氨基，在3300-3500cm-1之间出现双峰，同时羧基中的C=O向低频移动，为酰氨键中的C=O，与Fe3O4-COOH进一步结合后，游离的NH2消失，说明与Fe3O4上的羧基发生缩合反应。说明Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针共价组装的成功制备。3.2不同浓度四氧化三铁（Fe3O4）纳米粒子对MRI信号的影响首先准备PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），在37℃电热恒温水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入与EDC等量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和少许胱胺，继续孵育2小时。取5个1.5mL的EP管，编号为1—5，在其中都加入500μL的PEG-Gd2O3-SS-NH2；然后再分别在5个EP管中加入0.24mg/mL的Fe3O450μL（其中含Fe3O40.012mg）、100μL（其中含Fe3O40.024mg）、150μL（其中含Fe3O40.036mg）、200μL（其中含Fe3O40.048mg）、250μL（其中含Fe3O40.06mg）；在用移液器分别在5个EP管中加入蒸馏水216.7μL、163.2μL、110μL、56.6μL、3.4μL，配成总量一定的5个溶液。用高速冷冻离心机在10000转每分的条件离心10min，倒掉上清液，并分别分散于500μL蒸馏水中，最终制成5个Fe3O4浓度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。为了便于对比分析，每个样品分别配2管扫MRI，其中一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸馏水，另一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和与蒸馏水等量的谷胱甘肽（10mMGSH）。制成共10个样品扫MRI。结果如图3.2。图3.2不同浓度Fe3O4下GSH的MRI信号响应从图3.2可以看出，当有谷胱甘肽存在时，磁共振信号比没有谷胱甘肽时的磁共振信号亮度明显增强，当Fe3O4纳米粒子的含量为0.036mg时，图像的信噪比最大。所以，最终选择的Fe3O4最佳浓度为0.24mg/mL150μL，也即四氧化三铁质量为0.036mg时，图像信噪比最大，图像质量最高。3.3不同浓度氧化钆（PEG-Gd2O3）对MRI信号的影响首先也是准备PEG-Gd2O3-SS-NH2：取一定量的PEG-Gd2O3和乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），在37℃电热恒温水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入与EDC等量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和少许胱胺，继续孵育2小时。由于本实验中Fe3O4的量固定不变，所以EDC和NHS的量都不需改变。由3.2可知，四氧化三铁的最佳浓度为：0.036mg，所以在讨论氧化钆的最佳浓度时，四氧化三铁的浓度取最佳浓度。又由于在3.1中对四氧化三铁浓度优化时，选择氧化钆量为500μL，因此本实验中设置的氧化钆的浓度改变时必须包括500μL。然后取7个1.5mL的EP管，编号为1—7，在其中都加入150μL的0.24mg/mL的Fe3O4；然后分别在7个EP管中加入制备好的PEG-Gd2O3-SS-NH2100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、800μL；再用移液器分别在5个EP管中加入蒸馏水700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、0μL，配成总量一定的7个溶液。用高速冷冻离心机在10000转每分的条件离心10min，倒掉上清液，并分别分散于500μL蒸馏水中，最终制成7个PEG-Gd2O3浓度不同的Fe3O4-SS-Gd2O3溶液。为了便于对比分析，每个样品分别配2管扫MRI，其中一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和10μL蒸馏水，另一管加250μLFe3O4-SS-Gd2O3溶液和与蒸馏水等量的谷胱甘肽（10mMGSH）。制成共14个样品扫MRI。结果如图3.3。图3.3不同浓度PEG-Gd2O3下GSH的MRI信号响应从图3.3可以看出，当有谷胱甘肽存在时，磁共振信号比没有谷胱甘肽时的磁共振信号明显变明亮许多，当PEG-Gd2O3为500μL时，图像信噪比最大。所以认为PEG-Gd2O3的最佳浓度为500μL，当PEG-Gd2O3浓度为500μL时，图像信噪比最大，图像质量最高。3.4谷胱甘肽（GSH）对T1弛豫率的影响按照3.1和3.2描述的方法制备Fe3O4-SS-Gd2O310mL，准备14个0.5mL的EP管，分别编号为a1-a7（没有谷胱甘肽）、p1-p7（有谷胱甘肽），在a1-a7中分别加入250μLFe3O4-SS-Gd2O3、10μL蒸馏水，200μLFe3O4-SS-Gd2O3、60μL蒸馏水，150μLFe3O4-SS-Gd2O3、110μL蒸馏水，100μLFe3O4-SS-Gd2O3、160μL蒸馏水，50μLFe3O4-SS-Gd2O3、210μL蒸馏水，25μLFe3O4-SS-Gd2O3、235μL蒸馏水，260蒸馏水。p1-p7中Fe3O4-SS-Gd2O3分别与a1-a7相同，并加入与a1-a7中与蒸馏水等量的0.26mM的GSH。3.0T磁共振扫描T1弛豫率的回归方程如图3.4。图3.4GSH对不同浓度PEG-Gd2O3的MR信号T1弛豫率影响从图3.4曲线可以看出，当有谷胱甘肽存在时，不同浓度氧化钆的MR信号T1弛豫时间的回归方程为：y=0.62766+15.90626x，即有谷胱甘肽存在时，不同浓度氧化钆的MR信号T1弛豫率为15.90626。然而，当没有谷胱甘肽时，不同浓度氧化钆的MR信号T1弛豫时间的回归方程为：y=0.38554+5.73569x，即没有谷胱甘肽存在时，不同浓度氧化钆的MR信号T1弛豫率为5.73569。也就是说，有谷胱甘肽存在时的弛豫率是没有谷胱甘肽时的近3倍，说明所制备的纳米探针对谷胱甘肽有灵敏的MR响应，有望用于肿瘤细胞内GSH的MRI。3.5不同浓度谷胱甘肽（GSH）的MRI信号响应同理制备Fe3O4-SS-Gd2O33mL，准备12个0.5mL的EP管，编号为1-12，在12个EP管中都加入150μLFe3O4-SS-Gd2O3，1-12号EP管中分别加入110μL蒸馏水,109μL蒸馏水、0.5μL0.26MGSH、109.5μL蒸馏水，1μL0.26MGSH，2μL0.26MGSH、108μL蒸馏水，3μL0.26MGSH、107μL蒸馏水，4μL0.26MGSH、106μL蒸馏水，5μL0.26MGSH、105μL蒸馏水，6μL0.26mMGSH、104μL蒸馏水，7μL0.26MGSH、103μL蒸馏水，8μL0.26MGSH、102μL蒸馏水，9μL0.26MGSH、101μL蒸馏水，10μL0.26MGSH、100μL蒸馏水制成总量为260μL的12个样品。3.0T磁共振扫描的T1弛豫率的回归方程如图3.5。图3.5不同浓度GSH的MRIT1弛豫率由于肿瘤组织中GSH含量远远高于正常组织，从图3.5可以看出，当GSH浓度大于等于4mmol/L时，T1弛豫时间改变明显，文献记载肿瘤组织的GSH含量大于5mmol，而正常组织中GSH的含量约为0.5mmol。因此可激活纳米探针可以把肿瘤组织和正常组织区分开。达到特异性诊断肿瘤的目的。3.6讨论本章节首先通过控制单一变量的方法对制备的可激活磁共振对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针的浓度进行优化，从而最终确定Fe3O4最佳浓度为0.24mg/mL150μL，PEG-Gd2O3的最佳浓度为500μL；然后通过比较有无谷胱甘肽存在时材料的MRI扫描T1弛豫率，数据表明当有谷胱甘肽存在时，T1弛豫率明显提高，对比效果更佳，且当GSH浓度超过3mol/L时，弛豫率明显改变，而肿瘤组织中GSH高表达，从而可以实现对肿瘤组织的特异性诊断；最后通过傅里叶红外光谱分析对材料进行表征并比较，证明可激活磁共振对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针制备成功。4可激活MRI纳米探针Fe3O4-SS-Gd2O3的MTT测试随着免疫学、血液学和肿瘤学研究的不断深入和发展，科研部门和临床医院检测各种细胞和细胞因子活性等方面的工作日益增多，但是其检测方法多不尽人意。细胞毒性检测的方法有很多种，如MTT法，CCK-8法，LDH法等。这些方法虽各具优点，但都存在局限性。自从1983年美国学者Mosmamn建立了MTT比色法以来，以其快速、灵敏、简便、准确等优点受到人们的普遍重视，现已广泛应用于各个领域，例如检测细胞对化学药物的敏感性，刺激剂对免疫细胞的反应、免疫细胞毒性、细胞因子活性等[41]。因此本文选用MTT法进行细胞毒性实验。MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜进入细胞内，可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原，形成不溶于水的蓝紫色甲躜（Formazam）结晶。该结晶可溶于酸性异丙醇、二甲亚砜、SDS等有机溶剂中，再通过酶标仪依颜色深浅测定出各吸光度值。由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例，因此吸光度值的大小可反应细胞的数量及活性。为了将制备得到的Fe3O4-SS-Gd2O3可激活对比剂用于肿瘤细胞的MRI诊断，首先利用MTT测试考察了该纳米探针的生物相容性。4.1实验试剂及器材（1）所用试剂：乙基二甲基氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC），（美国Sigma公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），（美国Sigma公司）；改良型RPMI-1640培养基（Hyclone，赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）；胎牛血清(FBS，杭州四季青公司）；磷酸盐缓冲液(PBS，自配)；MTT粉末；胰酶（美国Giboc公司）；二甲基亚砜(DMSO，美国PIERCE公司）。（1）所用器材：-80℃冰箱，(日本SANYO公司)；4℃冰箱，（中国海尔集团）；-20℃冰箱，（中国海尔集团）；培养板，（美国Corning公司）；培养瓶，（美国Corning公司）；15mL及50mL离心管，（美国Corning公司）；EP管，（美国AXYGEN公司）；漩涡混合器(XH-C)，（金坛市白塔新宝仪器厂）；20mL、100mL、1000mL微量移液器，（德国Eppendorf公司）；移液器枪头，（美国AXYGEN公司）；医用净化工作台(YJ-1450D)，（苏州净化设备公司）；高速冷冻离心机，（美国Thermo公司）；低速离心机(KDC-40)，（科大创新股份有限公司中佳分公司）；电热恒温水槽(DK-8D)，（上海跃进医疗器械厂）；倒置显微镜，（日本奥林巴斯公司）；倒置荧光相差显微镜，型号：DMI3000B（德国，徕卡仪器有限公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；电热恒温干燥箱，（上海跃进医疗器械厂）；恒温CO2培养箱，（美国Thermo公司）；立式压力蒸汽灭菌器，型号LDZX—50KBS，（上海申安医疗仪器厂）。4.2NIH3T3小鼠成纤维细胞培养以下各项操作均在无菌细胞室进行，NIH3T3细胞培养条件为：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基、37℃5%CO2培养箱。所用实验器材如4.1所示。4.2.1NIH3T3小鼠成纤维细胞复苏（1）用具消毒：将培养细胞需要用到的培养瓶、枪头高压蒸汽灭菌30min，并放于电热恒温干燥箱干燥24小时后，取出置于超净工作台备用；（2）配制培养基：将RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、双抗按照90%：10%：1%的比例配好备用；（3）将冻存的NIH3T3细胞从液氮中取出，快速放入37℃的恒温水浴箱中，使之融化；（4）将融化的NIH3T3消毒放入超净台，用微量移液器将其转移到培养瓶中，并加入配制好的培养基5—10mL；（5）将培养瓶放于37℃、5％CO2培养箱中培养；（6）24h后，弃除旧的培养液，更换新的培养液，继续培养。4.2.2NIH3T3小鼠成纤维细胞传代（1）倒置显微镜下观察细胞，当细胞处于80％-90％汇合阶段时进行传代培养；（2）倒去培养瓶中的培养液，用5—10mL无菌PBS水洗涤1—2次，然后想瓶内加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解细胞；（3）室温下放置1-3min，倒置显微镜下观察培养瓶，当细胞质回缩至细胞形态近圆形时，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培养基终止消解，轻轻吹打瓶壁细胞，使之从培养瓶中脱离，形成细胞悬液；（4）将细胞悬液转移到10mL的离心管中，2000转离心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培养基使细胞分散均匀，分装入数个培养瓶中，一般1:3传代，但是本实验由于时间有限，为了让细胞快速生长，进行1:2传代。补充配置好的培养基5—10mL，将细胞培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。4.2.3NIH3T3小鼠成纤维细胞计数（1）用0.25%胰蛋白酶将贴壁的细胞消化下来，使之形成细胞悬液；（2）取计数用载玻片，盖上盖玻片，吸取少量细胞悬液滴到载玻片上，使载玻片与盖玻片之间充满细胞悬液；（3）倒置显微镜下计数载玻片上4个角的大计数格内的细胞总数。4.2.4NIH3T3小鼠成纤维细胞冻存（1）用胰蛋白酶消化细胞，脱壁后，立即用培养液中止消化，用巴氏吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。（2）室温下1000rpm离心5min。（3）加入适量的培养液，每瓶细胞加1.5mL-2mL。（4）加入1/10体积的DMSO，混合均匀。（5）分装至冻存管内，并将冻存管置于保温盒内，置于4℃冰箱2小时，取出，置于-20℃冰箱2小时，取出，置于-80℃冰箱保存。4.3786-0肾癌细胞培养以下各项操作均在无菌细胞室进行，NIH3T3细胞培养条件为：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基、37℃5%CO2培养箱。所用实验器材如4.1所示。4.3.1786-0肾癌细胞复苏（1）用具消毒：将培养细胞需要用到的培养瓶、枪头高压蒸汽灭菌30min，并放于电热恒温干燥箱干燥24小时后，取出置于超净工作台备用；（2）配制培养基：将RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、双抗按照90%：10%：1%的比例配好备用；（3）将冻存的786-0肾癌细胞从液氮中取出，快速放入37℃的恒温水浴箱中，使之融化；（4）将融化的786-0肾癌细胞消毒放入超净台，用微量移液器将其转移到培养瓶中，并加入配制好的培养基5—10mL；（5）将培养瓶放于37℃、5％CO2培养箱中培养；（6）24h后，弃除旧的培养液，更换新的培养液，继续培养。4.3.2786-0肾癌细胞传代（1）倒置显微镜下观察细胞，当细胞处于80％-90％汇合阶段时进行传代培养；（2）倒去培养瓶中的培养液，用5—10mL无菌PBS水洗涤1—2次，然后想瓶内加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解细胞；（3）室温下放置1-3min，倒置显微镜下观察培养瓶，当细胞质回缩至细胞形态近圆形时，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培养基终止消解，轻轻吹打瓶壁细胞，使之从培养瓶中脱离，形成细胞悬液；（4）将细胞悬液转移到10mL的离心管中，2000转离心10min；（5）倒掉上清液，加入1mL培养基使细胞分散均匀，分装入数个培养瓶中，一般1:3传代，但是本实验由于时间有限，为了让细胞快速生长，进行1:2传代。补充配置好的培养基5—10mL，将细胞培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。4.3.3786-0肾癌细胞计数（1）用0.25%胰蛋白酶将贴壁的细胞消化下来，使之形成细胞悬液；（2）取计数用载玻片，盖上盖玻片，吸取少量细胞悬液滴到载玻片上，使载玻片与盖玻片之间充满细胞悬液；（3）倒置显微镜下计数载玻片上4个角的大计数格(每个角16格)内的细胞总数(计数原则：数上不数下，数左不数右，细胞团块算1个细胞)；（4）按下式计算细胞浓度和细胞总数：细胞浓度=(四格细胞数和/4)×104(个/mL)细胞总数＝(四格细胞数和/4)×104×细胞悬液总体积(个)4.3.4786-0肾癌细胞冻存（1）用胰蛋白酶消化细胞，脱壁后，立即用培养液中止消化，用巴氏吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。（2）室温下1000rpm离心5min。（3）加入适量的培养液，每瓶细胞加1.5mL-2mL。（4）加入1/10体积的DMSO，混合均匀。（5）分装至冻存管内，并将冻存管置于保温盒内，置于4℃冰箱2小时，取出，置于-20℃冰箱2小时，取出，置于-80℃冰箱保存。4.4NIH3T3小鼠成纤维细胞、786-0肾癌细胞种板在做MTT测试之前，要将786-0肾癌细胞及NIH3T3小鼠成纤维细胞种到96孔细胞板中，在37℃5%CO2培养箱中培养24小时之后待细胞贴壁长满才可以进行加材料MTT测试等实验。以下各项操作均在无菌细胞室进行，所用实验器材如4.1所示。NIH3T3小鼠成纤维细胞种板的实验步骤为：（1）倒掉培养瓶内的培养基，用5—10MLPBS水洗涤一下,倒掉PBS水，加入500μL0.25%的胰蛋白酶消解细胞；（2）室温下放置1-3min，倒置显微镜下观察培养瓶，当细胞质回缩至细胞形态近圆形时，倒去胰蛋白酶，立即加入5—10mL培养基终止消解，轻轻吹打瓶壁细胞，使之从培养瓶中脱离，形成细胞悬液；（3）将细胞悬液转移到10mL的离心管中，2000转离心10min；（4）倒掉上清液，加入1mL培养基，用力振荡，使细胞分散均匀；（5）将（4）中细胞与培养基的混合液转移到50mLEP管中，继续加入14mL培养基，混合均匀；（6）用移液器将（5）中细胞与培养基的混合液种到96孔细胞板中，每孔加200μL，在种板过程中，注意及时混匀细胞与培养基，防止种板不均匀；（7）将种好的细胞板置于37℃5%CO2培养箱中培养24小时。786-0肾癌细胞的种板实验过程与NIH3T3小鼠成纤维细胞种板相似，此处不再赘述。待细胞全都贴壁长满之后，将制备好的Fe3O4-SS-Gd2O3可激活对比剂按照表4.1中对比剂与培养基的量加入细胞板。表4.1MTT测试之加材料表序号培养基Fe3O4-SS-Gd2O3材料浓度A1-A12100μL0μL0mM[Gd]B1-B698.3μL1.7μL3mM[Gd3+]0.05mM[Gd]B7-B1297.3μL2.7μL3mM[Gd3+]0.08mM[Gd]C1-C696.7μL3.3μL3mM[Gd3+]0.1mM[Gd]C7-C1295μL5μL3mM[Gd3+]0.15mM[Gd]D1-D693.3μL6.7μL3mM[Gd3+]0.2mM[Gd]D7-D1290μL10μL3mM[Gd3+]0.3mM[Gd]NIH3T3小鼠成纤维细胞板加材料的实验步骤为：（1）制备0.3mM[Gd3+]，3mM[Gd3+]：首先准备PEG-Gd2O3-SS-NH2：取5mL的PEG-Gd2O3和2.5mgEDC，在37℃电热恒温水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入与EDC等量的NHS和100μL胱胺，继续孵育2小时。准备Fe3O4-SS-Gd2O3：取1.5mL的0.24mg/mLFe3O4和4.5mgEDC、1.2mL蒸馏水，在37℃电热恒温水槽(DK-8D)中孵育15min，之后加入与EDC等量的NHS，继续孵育2小时。将3mM[Gd3+]稀释10倍即得到0.3mM[Gd3+]。（2）用移液器将细胞板中的培养基吸出，每孔加入200μLPBS水洗涤，吸出PBS，按照表二加Fe3O4-SS-Gd2O3和培养基。786-0肾癌细胞的加材料实验过程与NIH3T3小鼠成纤维细胞种板相似，此处不再赘述。4.5MTT测试将材料与细胞培养24h后，用倒置荧光显微镜拍摄出不同浓度下细胞的生长状态，然后把培养基移除，将MTT混合液（8mgMTT粉溶于1.6mLPBS和6.4mL不含血清的培养基，超声使其混合均匀）加入每个细胞孔中，孵育4h后，用BioTek公司的680酶标仪通过测量溶液的吸光度来检测细胞的相应能力。光学密度（OD）在波长为490nm时被读取，相应的细胞能力被表达为：（[OD]test/[OD]control）×100%。4.5.1786-0肾癌细胞形态表征如图4.1所示将不同浓度的Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针与肾癌细胞786-0作用24h后，通过倒置荧光显微镜观察细胞形态。图4.1不同浓度Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针与786-0作用24h后的细胞形态图4.1中随着材料浓度的增加，细胞的形态并未发生明显的改变，当Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针中[Gd3+]浓度低于0.2mM时，细胞形态均未发生明显变化，786-0肾癌细胞具有良好的细胞形态，由此说明Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针具有良好的生物相容性，可用于肿瘤细胞的成像诊断研究。4.5.2786-0肾癌细胞存活率测定采用MTT法定量评估Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针对细胞存活率的影响，结果如图4.2所示。图4.2786-0肾癌细胞存活率图4.2中表明在Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针中[Gd3+]浓度低于0.1mM时，细胞的存活率均在90%以上，当[Gd3+]浓度高于0.15mM时，细胞存活率明显降低。说明Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针具有良好的生物相容性，可作为MRI对比剂用于肿瘤细胞的MRI诊断。4.6讨论本章节利用MTT法考察了Fe3O4-SS-Gd2O3纳米材料的生物相容性。将纳米探针分别与肾癌细胞786-0和NIH-3T3细胞作用，利用倒置电子显微镜观察细胞形态，然后进行MTT测试，用酶标仪计算细胞存活率从而得出：该纳米探针在低浓度下对肿瘤细胞的毒性比较小，当[Gd]浓度高于0.15mM时，细胞存活率降低。因此，Fe3O4-SS-Gd2O3纳米材料的生物相容性较好。但是，由于小鼠成纤维细胞NIH-3T3种板不均匀，导致实验数据不准确，Fe3O4-SS-Gd2O3纳米材料对正常细胞的毒性还不得而知。5总结与展望5.1总结本文讨论了阳性对比剂氧化钆及阴性对比剂四氧化三铁的制备及对其性质进行了简单的研究。然后通过胱胺将两者连接形成可激活对比剂Fe3O4-SS-Gd2O3，可激活对比剂与目前临床应用最广泛的钆剂相比，具有弛豫率高、特异性强等优点。当有肿瘤细胞存在时，可激活对比剂的双硫键被打开，MRI信号增强，提高了肿瘤诊断的特异性与准确性。本文也通过MTT方法对制备的可激活对比剂进行生物相容性的研究，实验表明，当Fe3O4-SS-Gd2O3纳米探针中[Gd]浓度低于0.1mM时，细胞存活率较高，生物相容性较好。5.2展望本文仅仅讨论了尺寸为的四氧化三铁纳米粒子应用于可激活对比剂的成像效果研究，对于不同尺寸的四氧化三铁的研究还处于制备材料阶段。根据文献描述的方法，用同2.1相同的化学沉淀法制备3个样品：1号样品为在0.198gFeCl2和0.541gFeCl3加入3.5mL浓氨制成；2号样品为在0.9941gFeCl2和2.7029gFeCl3加入5mL浓氨制成；3号样品为在0.9941gFeCl2和2.7029gFeCl3加入3.6mL浓氨制成。样品如下图5.1。图5.13号样品-铁均被磁铁吸引从图5.1中可以看到，3号样品的磁性均很强，但是，做水和粒径发现3号样品的粒径分别为145nm、133nm、134nm，差别不是很大，无法用于后续实验。所以，我们又选择另外一种方法制备Fe3O4纳米粒子。首先配制氢氧化钠（NaOH）/DEG原液：称取2gNaOH溶于20mLDEG在氮气条件下加热到120℃、1小时，然后冷却至70℃并保持此温度；称取8gPAA(PolyacrylicAcid)和0.0648gFeCl3溶于17mLDEG在氮气条件下加热到220℃机械搅拌30分钟得到透明黄色液体；然后将1mLNaOH/DEG原液加入到透明黄色液体中（通过加入不同体积的NaOH/DEG原液以达到制备不同尺寸Fe3O4纳米粒子的目的），将温度降至210℃，溶液慢慢变黑，继续在氮气条件下恒温加热1小时。加热完全后，取出粘稠黑色溶液冷却至常温，用50%的乙醇洗涤，得到如下图5.2较透明的溶液。图5.2样品未被磁铁吸引从图5.2中可以看出，洗涤之后的液体中完全没有磁性物质，因此，本实验失败，没有合成Fe3O4纳米粒子。究其原因，主要有以下几点：首先，有可能是加入的NaOH/DEG原液的量太少，不足以反应出Fe3O4纳米粒子；其次，本实验需要使用四颈烧瓶，一个通氮气，一个通冷凝水，一个机械搅拌，一个放温度计，但是由于没有四颈烧瓶，所以必须“一颈两用”，“两用”的过程中可能会有氧气进入反应瓶中，发生还原反应，导致实验失败。因此，实验的下一步计划是继续尝试合成不同尺寸的Fe3O4纳米粒子与PEG-Gd2O3相连接，并研究它们的性质与不同，以确定可激活对比剂中的Fe3O4纳米粒子最佳尺寸。同时，本论文现阶段主要完成了可激活对比剂的细胞毒性实验，还需进一步研究其体外肿瘤细胞的靶向成像及在体实验。参考文献[1]曾益新．肿瘤学，第二版．北京：人民卫生出版社，2003：[2]JemalA,SiegelR,XuJ,etal.Cancerstatistics,2010.CACancerJClin,2010,6(5):277-300.[3]韩晓群,李著华,张敬各等.降低细胞内GSH浓度对乳腺癌细胞阿霉素敏感性的影响[J].四川大学学报（医学版）,2007,38(5):770-774.DOI:10.3969/j.issn.1672-173X.2007.05.005.[4] 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