(毕业论文)库拉索芦荟中多糖的提取及含量的测定正文终稿

PAGEIV摘要芦荟是一种多肉质地常绿草本植物，并且是一种营养丰富的蔬菜，被联合国粮农组织誉它为“21世纪人类最佳的保健品之一”。国际食品法典将其列为蔬菜。随着近年来科学的不断发展对芦荟的研究也不断深入，芦荟含有多种活性成分，通过不同的机制对人体产生多种生理功能，如能够促进伤口愈合、抗菌、降血糖、抗癌和抗病毒等一些生理功能。其中对芦荟的重要成分芦荟多糖的研究也到了一个新的领域，芦荟多糖有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗辐射等方面的活性功能。本文进行的是库拉所芦荟多糖的提取和含量的测定，首先通过单因素实验和正交实验对库拉索芦荟中的多糖提取工艺进行优化，然后再进行芦荟的叶渣和芦荟的凝胶中的多糖含量进行测定，并进行比较。本实验主要采取的是水提法进行芦荟多糖的提取，采用苯酚硫酸紫外分光光度法对芦荟多糖进行测定。确定了库拉索芦荟全株的多糖的提取工艺条件为提取次数为2次，提取时间为2h，料也比为1：10，浸提温度为90℃，醇沉浓度为80%，醇沉时间为6h，醇沉温度为室温。关键字：芦荟多糖；紫外分光广度法；正交实验法AbstrctAloeisasucculentevergreenherb,andanutrient-richvegetables,FAOreputationforitmankindinthe21stcenturythebesthealthcareproducts.CodexAlimentariustakeitasvegetables.Withthedeepeningofcontinuousdevelopmentinrecentyears,scientificresearchonaloeverahasverydeeply,aloeverahasmanyactiveingredients,avarietyofbiologicalfunctionsofthehumanbodythroughdifferentmechanisms,suchastheabilitytopromotewoundhealing,antibacterial,hypoglycemic,anti-cancerandanti-virusesandotherphysiologicalfunction.ImportantcomponentofaloepolysaccharideoftheAloetoanewfield,andaloepolysaccharideshaveanti-tumor,antioxidant,immunomodulatory,anti-virus,anti-radiationandotheraspectsoftheactivityfunction.ThisarticleistheKulathealoepolysaccharideextractionandcontentdetermination,andtooptimizetheextractionprocesstowaterextractionandethanolprecipitationmethodbytheorthogonalexperiment.Mainlyadoptedinthisexperimentistheextractionofwaterextractionandalcoholprecipitationaloepolysaccharides,andFrancesereydeproteinizeddecolorizedwithactivatedcarbon,thepolysaccharideextractedwithphenolsulfuricacidbyultravioletspectrophotometryaloepolysaccharidedetermination.Mentionandthewatertemperature,theconcentrationofalcoholprecipitationofsolidtoliquidratiooforthogonalexperimentalfactorsorthogonalexperiment,PolysaccharideofAloeverawholeplantextractionconditionsfortheextractiontimesof2,theextractiontimewas2h,theexpectedratioof1:10,extractiontemperature90℃,80%concentrationofthealcoholprecipitation,alcoholprecipitationtimeof6h,andalcoholprecipitationatroom.Keywords：aloepolysaccharides；ultravioletbreadthofFrance；orthogonalexperiment目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 IAbstrct II第一章前言 1第二章文献综述 22.1芦荟的研究进展 22.1.1芦荟的品种 22.1.2库拉所芦荟的形态特征 22.1.3国内芦荟资源现状 32.1.4国外芦荟的利用现状 32.1.5芦荟在国内的利用现状 42.2芦荟在各个领域的应用 42.2.1芦荟在医药上的应用 42.2.2芦荟在美容方面的应用 52.2.3芦荟在食品方面的作用 52.2.4芦荟的保健方面的作用 52.3芦荟多糖的研究进展 52.4芦荟多糖的生理功能 62.4.1抗氧化 62.4.2抗肿瘤 62.4.3降血糖 72.4.4对实验性胃溃疡有保护作用 72.4.5抗炎、抗艾滋病 72.4.6抗辐射 82.4.7保护肝脏 82.4.8创伤愈合 82.5芦荟多糖的结构 92.6芦荟多糖的提取工艺的优化 92.6.1单因素实验法 92.6.2正交实验法 10第三章实验部分 113.1实验材料 113.1.1库拉所芦荟 113.1.2实验药品 113.1.3实验设备 113.2试验方法 113.2.1芦荟多糖的提取工艺 113.2.2芦荟多糖的提取工艺 123.2.3总糖含量的测定 133.2.4单因素实验 133.2.5正交实验 143.3结果与分析 143.3.1苯酚-硫酸葡萄糖标准曲线 143.3.2单因素实验的结果分析 153.4正交实验数据分析 183.5正交实验的讨论 193.6验证试验 193.6.1验证试验 193.6.2验证试验的结论 203.7单因素实验对醇沉工艺的考察 203.7.1对醇沉浓度的确定 20图3-5醇沉浓度对提取率的影响 213.7.2醇沉时间对提取率的影响 21图3-7醇沉时间对提取率的影响 213.7.3醇沉温度对提取率的影响 213.8单因素实验结论 22通过单因素实验确定的醇沉工艺的最佳提取条件为，醇沉浓度为80%，醇沉时间为6h，醇沉温度为室温。 22第四章芦荟皮渣，芦荟全株，芦荟凝胶的多糖含量比较 234.1预处理 234.2实验条件的确定 23第五章结论与展望 245.1结论 245.2展望 24致谢 25参考文献 26PAGE28第一章前言芦荟是一种多年生常绿的多肉的草本植物，历史悠久，品种繁多，目前世界上有500多种，药用品中主要以木立芦荟和库拉索芦荟为主。库拉索芦荟是一种药用价值很高的植物，具有很多药理功能，其中多糖是现代研究对芦荟生物活性成分有突破性认识的重要化学成分。芦荟多糖具有免疫调节作用，研究发现，芦荟多糖可以的增强人的免疫能力，对免疫系统也有一定的调节作用，并可以用来治疗艾滋病。而且具有护肝养胃的作用，还能够抗氧化抗辐射抗，防止糖尿病，最重要的是芦荟多糖还有很好的抗肿瘤的效果。近年来对多糖的研究也是非常的热门，虫草多糖，灵芝多糖，木耳多糖等等，多糖也是重要的保健品的原料，所以对多糖的来源进行研究有很重要的意义，可以更大发挥多糖的作用。近年来国内外多芦荟多糖的研究也是进入了新的阶段。我国也加大了对芦荟产业发展的力度，2010年全国芦荟种植面积为0.3万hm2、规模化、集约化种植面积占40%。2011芦荟产业达120亿以上.我国芦荟的大多数产品都是由芦荟的凝胶成分制成的化妆品，还有一部分就是利用芦荟的抗菌消炎作用而制成的药品。然而本文对芦荟的多糖进行提取，通过对芦荟全株进行正交实验来确定最佳的提取工艺，再对芦荟的全株，芦荟的皮渣，芦荟的果肉进行芦荟多糖的提取和含量测定，并对其含量来进行比较。若芦荟的皮渣中多糖的含量可观，我们以后对芦荟的皮渣可以更好的利用。也希望为以后的芦荟多糖的研究，提供更多的参数。近年来对芦荟多糖的提取方法也多种多样，有超声波辅助提取法，酶解醇沉法，微波辅助提取多糖等等，本文选用的水提法进行多糖的提取，并通过苯酚-硫酸紫外分光光度法进行含量的测定。第二章文献综述2.1芦荟的研究进展近年来，芦荟在医药、保健品、化妆品领域的开发引起了国内外重视。芦荟品种繁多，变异多样，种质资源丰富，为人类的开发提供了广阔的前景。芦荟的化学成分十分复杂，各国学者已对其中多种主要成分进行了分析，其中包括种微量元素，种游离氨基酸，种有机物，维生素，蒽醌类，苷类，酚类，糖类等微量元素中所含的钙、镁、磷、钠、钾、氯、锰、鋅、铜、铬等矿物质能促进新陈代谢，供细胞养分，修复受损细胞，调节肌肤酸碱度氨基酸能维持生长，构成身体组织，形成荷尔蒙调节生理机能，合成抗体，增加抵抗力，修复受损细胞，延缓肌肤分化[1]。芦荟可引起腹泻，主要由于芦荟含有大黄素等多种蒽醌衍生物.从芦荟中分离得到的多糖可以促进淋巴细胞转化功能，同时对巨噬细胞增殖也有促进作用促进特异性抗体产生，诱导变态反应发生此外，芦荟中某种成分能提高艾滋病患者的免疫能力，阻断HIV的扩散。芦荟胶用于治疗创伤，促进损伤组织的再生新鲜芦荟胶液能增加身上伤口愈合，并缩短结疤时间其作用机制是芦荟胶增加胶原蛋白之间的交联，以提高其抗张强度。历史和现实已经证明，芦荟作为一种非常有价值的经济作物与人们的生活密切相关，并且在绿色产品开发和药物制剂中发挥着巨大作用我们一定要利用科学的武器，借鉴先进国家经验，把大面积种植芦荟和开发芦荟产业作为一项政府议事行为列入日程，让芦荟发挥它的更大的作用。2.1.1芦荟的品种芦荟的品种至少有300种以上，其中非洲大陆就有250，马达加斯加大约有40种，其余10种分布在阿拉伯等地。芦荟各个品种形状和性质差异很大，有的像巨大的乔木，高达20米左右；有的高度不及10厘米。按其用途可分为药用芦荟食用芦荟和观赏芦荟，其中药用芦荟有10多种，食用芦荟约5种，其余皆为观赏植物常见的品种有库拉索芦荟、好望角芦荟、中国芦荟、木剑式芦荟、帝王锦七、宝锦芦荟、青鳄芦荟、珍珠芦荟、龙角芦荟等。药用的芦荟以库拉索芦荟和木立芦荟为主。2.1.2库拉所芦荟的形态特征图2-1库拉所芦荟茎极短叶簇生于茎顶，直立或近于直立，肥厚多汁；呈狭披针形，长15～36cm，宽2～6cm，先端长渐尖，基部宽阔，粉绿色，边缘有刺状小齿。花茎单生或稍分枝，高60～90cm；总状花序疏散；花点垂，长约2.5cm，黄色或有赤色斑点；花被管状，6裂，裂片稍外弯；雄蕊6，花药丁字着生；雌蕊1，3室，每室有多数胚珠。蒴果，三角形，室背开裂。花期2-3月。芦荟盛产于非洲北部干旱地区，南海和地中海地区也有，我国福建地区和云南地区盛产[2]。图2-1库拉索芦荟图2-1库拉所芦荟2.1.3国内芦荟资源现状我国芦荟的种植主要集中在福建和云南地区，现在我国栽培的主要芦荟种类有库拉索芦荟、木立芦荟、中国芦荟、皂质芦荟、珍珠芦荟、海南大叶芦荟[4]等。2002年全国种植面积仅为1万亩，计划2005年达5万亩，产值10亿元经过多年的发展，芦荟已成为食品、化妆品、洗涤用品、保健食品、医药等重要的关键功效成分。2010年，全国芦荟产业产值超过90亿元，2011年预计增长30%以上。有数据显示，2010年，全国芦荟种植面积约为5万亩，规模化、集约化种植面积40%。芦荟产业经历20多年的坎坷道路，已成为我国健康产业的重要组成部分，2011年芦荟产值达到120亿元以上。这是从去年东中山举行的中国芦荟产业发展研讨会暨2011年芦荟产业专业委员会年会上获悉的。会上首次推出我国第一部规划指导芦荟产业发展“绿皮书”《芦荟产业“十二五”科技创新指导规划》。“绿皮书”提出我国芦荟产业“十二五”科技创新的指导思想、战略目标、重点任务和保障措施，力求使芦荟产业在国家层面通过科技创新，引导产业建立健全可持续发展长效机制。2.1.4国外芦荟的利用现状目前欧美以芦荟(Aloe)为原料的化妆品、保健药物约占80%以上，仅美国就有1500多种芦荟产品，据国际芦荟协会(IASE)报道，1997年全球芦荟原料及其制成品销售额已达650亿美元。国外名贵化妆品80%均用芦荟作原料。在国外关于芦荟的研究论文和专利层出不穷。据不完全统计,20世纪70年代有关芦荟的专利只有13件,而80年代则高达157件。其中用于药品的占36%,化妆品占25%,保健饮料、食品占22%,1986～1993年，仅在美国申请含芦荟成分的专利就有594件。据统计，日本有关芦荟研究开发方面的专利和论文比美国还多。在美国库拉索芦荟主要被制成凝胶原汁，果味凝胶汁，含芦荟凝胶的颗粒果汁,软、硬胶囊，外用芦荟制品等产品，其中复合型产品较多。在日本和韩国，则主要被用来制成芦荟酸奶，芦荟果冻，软、硬胶囊及外用药。美国、日本和韩国已批准将部分芦荟制品作为营养补充剂进行销售,进一步拓宽了市场。2.1.5芦荟在国内的利用现状在中国芦荟的发展比较晚，20世纪90年代初，福建黑牡丹公司和蒲田智舟公司就开始搞了组培育种及部分化妆品，开创了将芦荟作为产业来发展的第一例，并获福建省科技星火奖。接着北京轻工业学院海口公司等企业和科研单位开始从事芦荟的研究和生产，并取得了一些可喜的成绩。但是，我国芦荟的生产加工还主要是以初级和次级原料为主，主要用于食品、化妆品及保健食品，目前还没有专门的芦荟药物。初级产品指的是天然存在或简单加工处理得到的产品、半成品，此类产品较为完整的保留了芦荟原料中的各类成分。市场上的初级产品主要有：芦荟丁、脱色凝胶浓缩液、脱色凝胶原液、凝胶浓缩液、凝胶原液、脱色全叶粉、未脱色全叶粉、干叶片、芦荟茶、脱色全叶芦荟浓缩汁等。次级产品指的是在初级产品的基础上，通过较为先进的技术手段进行加工处理，有目的得到或去除芦荟中的一(几)种(类)成分，此类产品具有较高的附加值，譬如：对芦荟浓缩清液进行乙醇沉淀处理后，再用乙醇、丙酮洗涤，然后冷冻干燥，制成初级芦荟多糖产品；经酶解反应、真空浓缩后的芦荟浓缩清液再进行过滤膜分离浓缩、固液分离、乙醇和丙酮洗涤冷冻干燥制成二级芦荟多糖产品；对过滤膜分离的浓缩产物再用凝胶色谱柱进行柱层析提纯、然后冷冻干燥制成一级芦荟多糖产品。目前国内只有少数大型芦荟原料生产企业具备这种加工能力。此外，次级芦荟产品还包括分离提取得到的蒽醌类物质，分离浓缩得到的富含矿物质和微量元素的矿物晶以及采取极温和的工艺得到的活性酶[3]。2.2芦荟在各个领域的应用近年来，由于人们对芦荟的大力研究，使荟在各个领域的应用能够得到了很大的发展，如医药，化工，食品等，使其身价倍增。2.2.1芦荟在医药上的应用我国人民对芦荟在医药上的应用，很早就有了很多的研究，中医学上以芦荟的汁液浓缩干燥成块后入药，有清热杀虫，主治小儿疟疾，热结便秘等症。国产的芦荟在民间也可作草药用有通便，催经，凉血，止痛的作用，芦荟由于有特殊功能，经济价值大，早已引起了国外科学家的注意，前在美国日本等发达国家，都对芦荟进行了系统的研究，从品种的选育，繁殖，栽培到产品的开发和应用，都分别取得了一定得成果。前苏联曾把芦荟汁作为眼科用药，德国试用芦荟制剂治疗各种疑难疾病，日本研究用芦荟来治癌,泰国试验用芦荟治艾滋病等等[4]。2.2.2芦荟在美容方面的应用芦荟含有许多与美容保健的成分，各种维生素（C，B1，B2，B6及B12等）。多种氨基酸和复合多糖成分，还含有清除自由基的SOD等，芦荟中的天然保湿分子在美容方面起着很重要的作用。所谓天然保湿分子，是由多糖类和各种氨基酸通过复杂的化学反应形成的。它能够补充皮肤中损失的水分，是恢复胶原蛋白功能。国外的一般化妆品中多采用从牛眼中或脐带中提取透明质酸作为保湿子，但价值比较昂贵，芦荟相较于动物脏器相比，价值便宜得多，而且自由基清除剂SOD，使芦荟保健美容的功效更为突出。芦荟中含有能吸收紫外的成分，因而可以制成防晒霜，以防止阳光对皮肤的灼烧[5]。2.2.3芦荟在食品方面的作用随着人们对芦荟的不断认识，芦荟现在的用途越来越广，在食品方面更是把芦荟做成美味的食品，有些地区把芦荟做成美味的菜肴端上餐桌。除此之外，有些商家也把芦荟做成个种的饮料，牛奶等等。让芦荟的用途更加多，也给人们的生活带来更多的健康。2.2.4芦荟的保健方面的作用芦荟本身含有许多对人类保健的有效成分，所以国外许多食品公司，纷纷研究试制芦荟保健食品，如芦荟饮料，芦荟糖果，保健茶，芦荟酒等。我国有丰富的芦荟资源，如能充分加以开发利用，对化工、食品、医药各个行业业都大有好处，但在这方而似尚未引起国人足够的重视，在芦荟的生产和利用方而，目前在国内基木上尚是空白的，仅有少数几个研究所制出实验室产品，尚未进入工业化生产阶段，值得一提的是福建莆田地区有一年青企业家刘兴家，白置田地13亩，种植芦荟，开办工厂，化妆品食品已投放市场，取得一定的经济效益，该厂并与福建中医学院科研处合作试制成易拉罐芦荟饮料，为我国芦荟事业奠定了基础，希望各方给以支持和扶植[6]。2.3芦荟多糖的研究进展近年来，芦荟在医药、保健品、化妆品领域的开发引起了国内外重视。芦荟品种繁多，变异多样，种质资源丰富，为人类的开发提供了广阔的前景。芦荟的重要活性成分是多糖，从结构上看，多糖的生理活性不在糖链本身，而在其分枝程度位置。不同品种的芦荟其多糖成分、量和糖链的连接差别很大。从芦荟中已发现糖的种类有：甘露葡聚糖、甘露聚糖、果胶酸及乙酰化的(1-4)-甘露聚糖。目前，关于芦荟多糖的研究仍然是芦荟研究领域的热点之一。国内外研究表明，芦荟多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保肝、降血糖、促进创伤和溃疡愈合及抗炎、抗病毒等多方面的药理活性。但已有的研究多为动物实验研究，其研究成果多数尚待临床研究证实，且关于其药理活性的作用机制多未阐明。未来的研究应在现有成果的基础上，一方面继续加大芦荟多糖的研究力度，获取可靠的实验室证据，弄清其药理活性的作用机制；另一方面，应积极开展系统的临床研究，将实验研究结果证之于临床，在疾病防治方面充分发挥其作用。同时，通过多方位的系统研究,进一步促进芦荟研究向产业化方向发展[7]。2.4芦荟多糖的生理功能目前，关于芦荟多糖的研究仍然是芦荟研究领域的热点之一。国内外研究表明，芦荟多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保肝、降血糖、促进创伤和溃疡愈合及抗炎、抗病毒等多方面的药理活性。芦荟多糖(acemannan,ACM)尤其是B(1，4)位连接D2甘露糖的乙酰葡聚糖是芦荟的主要有效成分，具有较好的免疫调节、抗肿瘤、抗炎、解毒等作用[8]。2.4.1抗氧化当体内活性氧大量产生，其产生速率超过了超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶和抗氧化物质清除剂的限度时，脂质过氧化产物就会大量积累，造成对细胞和机癌变、炎症以及免疫性疾病等都与自由基代谢失衡有关。因此，提高机体的抗氧化能力，可以对抗由活性氧及其引发的脂质过氧化产生的疾病[12]。张方乐[13]等通过测定芦荟多糖的体外抗氧化活性，得出其抗氧化能力相当于9.928μmol/l的硫酸亚铁。吴广枫[14]等研究了库拉索芦荟多糖的体外抗氧化活性。实验证明，库拉索芦荟多糖具有较高的清除O2·和H2O2能力，但对·OH的清除能力较弱，对脂质过氧化无明显抑制[9]。2.4.2抗肿瘤多糖抗肿瘤机制主要有：（1）免疫调节作用：多糖是一种免疫调节剂，不但能激活T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞活性，激活网状内皮系统（RES）吞噬、清除老化细胞和异物已及病原体的作用，还能促进IL-1、IL-2、INF-γ等生成，调节机体抗体和补体的形成，提高机体抗肿瘤免疫力。（2）影响细胞生化代谢：磷脂酰肌醇(PI)存在于细胞膜与内质网，细胞膜上的PI在PI激酶催化下发生磷酸化反应生成磷脂酰肌醇磷酸(PIP)，该过程称为PI转换。（3）抑制肿瘤细胞周期：细胞周期与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等有密切关系。有研究表明，某些多糖在体外对肿瘤细胞的生长有抑制作用，其作用机制与细胞周期改变以及某些相关基因的表达有关。（4）抗氧化作用：恶性肿瘤患者血液或组织中超氧化自由基的特异性清除SOD活性及CAT的活性明显下降，而脂质过氧化物(LPO)含量增高，DNA被过量的活性氧氧化损伤造成碱基破坏，如果持续损伤或不能有效地修复，则导致细胞癌变。皮文霞等从中华芦荟凝胶冻干粉中提取分离得到纯多糖，通过MTT法观察其体外抗肿瘤活性，实验证明，芦荟多糖对人肝癌细胞（SMMC-7721）、人胃癌细胞（BGC-823）及人肺癌细胞（A549）的增殖均有抑制作用。贾绍华[17]等研究库拉索芦荟多糖对S180小鼠红细胞免疫调节因子活性的影响，采用郭峰法测定库拉索芦荟多糖可显著提高S180小鼠红细胞G3b受体花环促进率，降低其抑制率，因而从红细胞免疫角度，来揭示芦荟多糖具有抗肿瘤及提高机体免疫的功能[10]。2.4.3降血糖多糖降血糖作用可能的机制包括：促进葡萄糖转运及外周围组织、靶器官对糖的利用，降低血中甘油三脂和胆固醇的水平；保护胰岛β细胞，促进胰岛稳定分泌胰岛素；影响糖代谢酶的活性，促进糖原合成或抑制肝糖异生；促进降糖激素和抑制升糖激素作用。很多药物的降血糖作用不是从单一环节，而是从多方面、多靶点综合产生药效的。崔[18]从库拉索芦荟中提取芦荟多糖，采用腹腔注射STZ200mg/kg体重的方法制备糖尿病小鼠模型，然后用浓度为200mg/kg的芦荟多糖对模型小鼠进行灌胃处理，2周后，血糖水平比处理前降低了40.02％(P＜0.01)，血清胰岛素水平也有不同程度的提高，证明芦荟多糖具有一定的降血糖活性[11]。2.4.4对实验性胃溃疡有保护作用芦荟多糖对实验性胃溃疡的预防保护作用阎中国芦荟的多糖成分对拘束水浸应激性胃溃疡、消炎痛溃疡、乙醇溃疡初步观察，表明均有较好的预防保护作用，其抗溃疡作用可能通过抗攻击因子实现的，从中国芦荟的毒性和生理功能多项试验结果表明，中国芦荟与其原种翠叶芦荟相比基本一致，由于中国芦荟大黄素葱酿类化合物少，因此，中国芦荟用于保健食品更为安全可靠，而用于化妆品添加剂就更为理想[12]。2.4.5抗炎、抗艾滋病对587例患者的回顾性研究和607例患者的前瞻性研究表明，含Acemannan凝胶的填絮可有效减轻拔牙后牙槽骨炎的发生率，与含克林霉素抗生素类药物的吸收性明胶海绵相比具有显著性差异。Aceman2nan是芦荟多糖的一种，是一个交替的带有乙酰基的β链式的甘露聚糖，它只有到达靶细胞才被代谢。Acemannan已被美国FDA批准为应用于人体治疗艾滋病的药物，经临床验证，它是目前治疗人体免疫缺损的最有效药物。研究表明，Acemannan有抗艾滋病病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)的作用。体外实验也证明，Acemannan单独或联多夫定与阿昔洛韦可对1型人类免疫缺陷病毒(humanimmuno2deficiencyvirustype1，HIV21)的复制有抑制作用，并认为Acemannan对HIVk21及其他有胞膜病毒的抗病毒作用与改变病毒糖蛋白糖基化有关[13]。2.4.6抗辐射电离辐射是治疗恶性肿瘤的有效手段之一，但同时也对正常组织和器官造成严重的不良反应，因而限制了其临床应用。因此，能够有效降低放射治疗对正常组织所造成的损伤的物质将有助于增加放射剂量和提高放射治疗效果。王宗伟等研究表明，芦荟多糖对辐射动物具有显著的保护作用，对非瘤细胞辐射后细胞凋亡及凋亡蛋白的表达也有显著调节作用。芦荟多糖对X射线照射后非瘤细胞的辐射防护作用与改善细胞周期紊乱有关，对X射线辐射后非瘤细胞周期紊乱的改善作用与对周期相关蛋白表达的调节有关，对辐射小鼠胸腺细胞的保护作用与改善细胞周期紊乱、抑制细胞凋亡有关[14]。2.4.7保护肝脏张晓林等研究表明，中华芦荟多糖能显著降低大、小鼠血清ALT和AST活性，提高大、小鼠肝脏SOD活性，降低肝脏MDA含量，对四氯化碳(CCl4)造成的急性小鼠肝脏损伤和慢性大鼠肝脏损伤有明显的保护作用，其机制与提高大、小鼠的抗氧化能力有关。何敬钊等[22]研究证实，口服012g/kg和016g/kg中华芦荟多糖溶液可以降低CCl4所致肝中毒小鼠血清中ALT和AST水平；腹腔注射200mg/kg和500mg/kg中华芦荟多糖溶液可以明显降低D-半乳糖胺盐酸盐所致肝中毒大鼠血清ALT和AST水平，从而对受损动物的肝脏有一定的保护作用[15]。2.4.8创伤愈合创面的愈合是一个复杂过程。人们很早就认识到芦荟有很好的愈合创伤作用。研究表明，芦荟能使创面肉芽组织中透明质酸和硫酸软骨B的含量提高，并能促进细胞外基质中葡萄糖胺聚糖(GAGs)合成，从而改善创面状况；冻干芦荟凝胶能明显改善Ⅱ度烧伤大鼠的皮肤微循环及白细胞浸润程度，促进创面愈合。现代研究认为，芦荟的创伤愈合作用与巨噬细胞活化和促进神经细胞增殖有关。从芦荟凝胶分离得到的糖蛋白对人正常真皮细胞和幼仑鼠肾细胞有促进增殖的作用[16]。2.5芦荟多糖的结构糖类是芦荟叶凝胶部分除去水分外的主要成分，芦荟凝胶干燥后所得固形物中大约一半以上是糖类，经分析所含单糖有甘露糖、阿拉伯搪、鼠李糖、果糖、葡萄糖等。芦荟所含塘类中具有重要生物活性作用的是多糖。多糖是芦荟中凝胶的组成成分，经实验，芦荟凝胶中的多糖为0.27%～0.5%。芦荟原汁干燥物种多糖的含量为18%～30%，其多糖的含量与芦荟的生长地区的不同而有区别，还与芦荟的生长季节等多方面都有关系。芦荟叶中所含的多糖经色谱和波普的分析确定其中组成之一是由线性β-（1，4）-D-甘露糖基单元连接而成的聚合物，该聚合物与蛋白结合形成糖蛋白。现在比较流行的对芦荟多糖结构进行具体的研究源自美国McAnalley(卡林顿实验室)。他们命名部分纯化的芦荟多糖为“Accmannan”。“Accmannan”是一种取自芦荟凝胶纯化的白色非晶体粉末。他基本是由线性β-（1，4）-D-甘露糖单元组成的一种长链聚合物。聚合物中任意地分布着通过氧原子而与其连接的乙酞基团。测得乙酞化程度大约为0.8个乙酞基团/单体。中性糖键分析表明，（多半）通过α（2-6）键而与链连接的是D-吡喃半乳糖残基，比例大约为七十个糖中含有一个D-吡喃半乳糖残基。甘露糖与半乳糖之比为20：1.这表明半乳糖单元之间主要β-（1，4）配糖键连接。通过元素分析，红外光谱、核磁共振、质谱和乙酞基官能团分析等，芦荟葡甘聚糖非常接近于纤维多糖（β-1，4葡萄糖）是葡萄糖与甘露糖化学上非常相似，所不同的只是一个氧原子的取向不同。纤维素和芦荟的葡甘露聚糖二者均能被专一的纤维素酶所裂解，它们二者之间具有相似性，所不同的2，3和6羟基乙酰化的空间位置不同，使它们的溶解度和表面活性能量有所不同，在纤维素或乙酞化的芦荟葡甘露聚糖带有很少的负电荷。其它两种多糖，从Alovbarbadensis中已经被纯化和表征，其中之一主要是半乳糖组成的，它的化学性质和葡萄糖、甘露糖非常不同，芦荟葡甘露聚糖一样，半乳糖是不带电荷的中性多糖。第三种芦荟多糖是带有半乳糖酸的酸性糖，溶解后带负电荷。芦荟的酸性多糖非常相似植物多糖果胶。在近数年芦荟多糖的研究中，主要结果与Gowea及其同事或Mandal或Das相同[17]。2.6芦荟多糖的提取工艺的优化2.6.1单因素实验法因素试验法作为优化培养的传统方法，简单，易行，结果直观，但对于考察多因素的优化培养，不仅浪费时间，更容易产生错误的结论，故常用作初步优化试验。单因素试验是在假设各因素之间不会相互影响的前提下，通过每次只改变一个因素，保证其他因素不变的条件下，研究不同因素对结果的影响，通过对逐个因素的考察，做最初的优化培养。对于大部分组分相当复杂的多糖提取工艺而言，仅通过单因素试验通常无法达到最优的效果，特别是在影响因素很多的情况下，要完成各因素的逐个优化，需要较多的时间来进行试验，因此，单因素试验经常被用在正交试验之前或与均匀设计、响应面分析等结合使用。利用单因子试验和正交试验相结合的方法，通过少量试验确定各因素之间关系以及最佳提取工艺的方法。较常见的优化培养方法是先通过单因素试验确定浸提温度，提取时间，醇沉温度，料也比再进行正交试验，或者通过单因素试验直接确定，再进行正交试验[50]。2.6.2正交实验法在多因素实验中，为了得到正确的结论，按理应对每个因素的各水平都进行全面搭配的实验才是最好的方法。但当要考虑的因素水平数较多时，全面实验的数目就会变成一个天文数字，短时间之内难以完成。正交实验设计正好可以解决这个难题。它是以概率论和数理统计为理论基础，科学地安排多因素实验的一类实用性很强的数学方法，它所研究的内容是如何合理地安排实验以使实验次数尽可能少，并能正确地分析实验数据。正交实验可以解决以下几个问题：因素的主次，即各因素对所考察指标的影响的大小顺序；因素与指标的关系，即每个因素各水平不同时，指标是怎样变化的；什么是较好的生产条件或工艺条件；进一步实验的方向。正交试验法更全面，更精确的描述了各因素之间的作用，确定最佳培养方案。正交实验设计其实就是利用一套现成的规格化的表，表来安排多因素实验,并对试验结果进行统计分析,找出较优实验方案的一种科学方法。正交表常记为Ln(tm),其中L-正交表符号,n-正交表安排的实验次数,即正交表行数,m-正交表列数(最多可安排因素的个数),t-每个因素的水平数。正交实验的科学性表现为正交表的两个特性,一是整齐可比性,即表中任一列所含各种水平的个数都相同；二是均衡搭配性,表中任何两列中所有各种可能的数对出现的次数都相同。因此,用正交表安排的实验对其中任意两个因素来说是具有相同重复次数的全面实验,代表性强,效率高。对于考虑多因素多水平的涂料配方、纸浆漂白等实验来讲无疑是最佳的实验设计方法。正交实验的数据分析方法主要有两种,一是直观性比较强也较简单的极差分析法,另外一种是分析比较全面计算量也较大的方差分析法。第三章实验部分3.1实验材料3.1.1库拉所芦荟优质库拉索芦荟,市售3.1.2实验药品(1)葡萄糖标品（分析纯）中国医药上海化学试剂公司(2)三氯甲烷（分析纯）北京化工厂(3)正丁醇（分析纯）北京化工厂(4)95%的乙醇（分析纯）北京化工厂(5)浓硫酸（分析纯）天津福晨化学试剂厂(6)苯酚（分析纯）郑州明欣化工产品有限公司(7)活性炭（分析纯）天津市美化泰克科技有限公司3.1.3实验设备(1)分析天平，感量0.01g，北京赛多利斯天平有限公司(2)DK-8D型电热恒温水槽，上海医用恒温设备厂(3)101-A点热鼓风干燥箱，上海医用恒温设备厂(4)721分光光度计，上海精密科学仪器有限公司(5)组织捣碎机，常州国安赛尔包装机械有限公司(6)DHZ-DⅢ型循环水真空泵，义市英峪华予仪器制造厂3.2试验方法3.2.1芦荟多糖的提取工艺芦荟清洗→称取→捣碎→加水→热水浸提→减压抽滤→浓缩→醇沉→过滤→去蛋白→脱色→醇沉→过滤→用水溶解→定容→测量3.2.2芦荟多糖的提取工艺芦荟多糖的捣碎用组织捣碎机把称好的芦荟捣碎，确保细胞破碎，才能够最大限度的提取芦荟当中的多糖。热水浸提将捣碎的芦荟匀浆以一定的料液，料液比为m/v是芦荟的质量与水的体积之比，一定的浸提温度和一定的浸提时间进行多糖的提取，冷去后进行过滤分离。浓缩对所得到的上清液进行浓缩，浓缩到一定的体积。醇沉向浓缩的的上清液中加入一定体积的95%的乙醇，使醇能够达到一定的浓度，然后静置隔夜，再进行过滤，收集沉淀。Sevage法脱蛋白将正丁醇与三氯甲烷以1：1的比例混合，取得的混合溶液加入所得的沉淀进行充分的震荡，直到蛋白沉淀析出为止，取得上清液。Sevage法脱蛋白条件温和，处理后的糖类性质不变，本文用此法去除粗总糖中的蛋白。活性炭脱色芦荟多糖的溶液经浓缩后颜色较深，含有多种色素，影响生产工艺指标的选定和最终成品的质量，必须加以去除。脱色用活性炭除吸附有色物质外还能除浊、除臭，降低糖浆的灰分含量，提高产品稳定性等。将所得的上清液加入一定的活性炭进行脱色，放到热水浴中煮30～40min。二次醇沉将活性炭脱色后的溶液进行醇沉，加入一定量的95%的乙醇，进行最后一次的去除杂质，使得到得粗多糖的杂志质尽可能的减少，使多糖尽可能的纯化。过滤溶解并且定容过滤到滤纸上的粗多糖，用蒸馏水冲洗，并且把所得的多糖溶液定容100ml的容量瓶中，进行含量的测定。3.2.3总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法测定总糖含量。苯酚-硫酸试剂可与游离的单糖或寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸以及糖的甲基衍生物发生显色反应，己糖在490nm(戊糖及糖醛酸在480nm)处有最大吸收，并且吸收值与糖含量呈线性关系。准确称取85℃干燥至恒重的无水葡萄糖25mg于250mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.1ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，用水补至1.0ml，后加入6%苯酚0.5ml及浓硫酸2.5ml，摇匀，室温放置30分钟后在490nm测吸光度，以1.0ml水按同样的显色操作为空白，横坐标为糖微克数，纵坐标为吸光度值，得到标准曲线。取样品液l.0ml，按以上操作步骤测定吸光度值，从标准曲线上查知对应糖微克数，测得样品含量。总糖提取率=×100%（公式3-1）3.2.4单因素实验据现有的糖类研究资料结果表明，影响总糖提取率的因素有浸提温度、浸提时间、料水比、浸提次数等。因而为确定芦荟多糖的提取工艺，本试验主要从提取次数、料水比、浸提温度、浸提时间等因素来考察，从而为正交试验设计的水平提供有意义的参考范围。每组试验分别进行3次平行试验，总糖提取率以其3次试验的平均值计。提取次数的确定试验数据是在料液比为1：8，温度为80℃，浸提时间为2h的提取工艺下操作所得，次数为一次，两次，三次。浸提温度的确定试验采用了浸提温度分别为100℃，90℃，80℃，70℃，和60℃的五个水平，在浸提时间为2h，提取次数为2，料液比为1：8的条件下进行试验操作。料液比的影响试验采用了料液比分别为1：15，1：10，1：8，1：4和1：2(g/ml)的五个水平，依据浸提时间2h，提取次数为2，在浸提温度为80℃的条件下进行试验操作。浸提时间的影响实验采用了浸提时间分别为0.5h，1h，1.5h，2h，3h的五个水平，提取次数为2，浸提温度为80℃和料液比1：8来进行试验。3.2.5正交实验选取主要影响因素料液比、浸提温度、浸提时间、提取次数四项为考察因素，依据L9(34)正交试验表进行设计，以确定芦荟多糖提取的最适工艺。表3-1正交因素水平表水平提取次数浸提温度（℃）提取时间（h）料液比(w/v）ABCD117011：522801．51：8339021：103.3结果与分析3.3.1苯酚-硫酸葡萄糖标准曲线根据苯酚—硫酸法制作的葡萄糖标准曲线的实验数据为表3-2和制作的葡萄糖标准曲线如图3-1.表3-2葡萄糖标准曲线的测量数据葡萄糖加入量（ug）吸光度A00.001100.099200.173400.319600.456800.6151000.757图3-1葡萄糖标准曲线3.3.2单因素实验的结果分析提取次数对提取率的影响试验数据是在料液比为1：8，度为80℃，浸提时间为2h的提取工艺下操作所得，结果见表3-3，一次水提操作的多糖提取率很小，而提取次数的增加提取率增加，但是增加的幅度并不是很大，由此可以表明，提取两次多糖基本已经浸提完全，再进提一次并没有多大影响，因此从经济角度考虑，进行二次热水浸提的操作设计较为合理，无需重复第三次操作，所以浸提次数2次为最佳的。表3-3提取次数对提取率的影响提取次数提取率（%）10.232120.277630.278浸提温度的影响温度对总糖提取率的影响见图3-2知，温度在60℃～90℃的范围内，随着温度的增加，总糖提取率呈上升趋势，并于90℃达到最大值0.2919%由于温度的升高使得分子运动加快、传质速率也随之变快、溶解度增加的原因造成的；随后在温度达到100℃以后，出现提取率略为回落的现象，这可能是因为高温下部分糖被破坏引起的。另外，从各温度下提取率值的增幅情况可以看出，在60℃到90℃的范围，温度的改变导致提取率值的增幅较大。试验中还发现，由于美拉德效应，温度越高，提取液颜色越深，提取液中色素等杂质增多。由上分析可知，温度在提取工艺控制中占有重要作用，对总糖的提取率影响较大。由于资源和成本考虑最佳浸提温度为90℃。此时芦荟多糖的最佳提取工艺设计为浸提时间为2h，提取次数为2，料液比1:8，浸提温度为90℃。图3-2温度对提取率的影响料液比的影响料液比对总糖提取率的影响见图3-4。由图可知，料液比在1：2～1：8的范围内，随着料液比的增加，总糖提取率成上升趋势；而在料液比达到1：10时，虽有所下降，但提取率仍在0.2741%以上。这种现象的产生可能是由于在相同溶解度状态下，随着溶剂质量的增加，溶质溶解质量也随之上升的原因造成的，即料液比的增加使更多糖类溶解在热水中的缘故；至于在1：5时出现下降现象则可能是由于此时的溶质量在恒定的情况下，不会再产生较大改变，也就是说在此溶解度下，总糖已基本溶解，数值的变动也可能为试验误差引起的。由上分析可知，其最佳料液比为1：8。因此此时芦荟多糖最佳提取工艺设计为浸提温度为80℃，浸提时间为2h，浸提次数为2，料液比为1：8。图3-3料液比对提取率的影响浸提时间的影响提取时间对总糖提取率的影响见图3-3。由图可知，浸提时间从0.5h延长至1.5h时，总糖的提取率有了一个较为明显的上升，这可能是此时芦荟的总糖向热水中溶解提取的时间更加充分的缘故，此时的时间变化对提取率的影响较为显著；随后延长至2小时，提取率达到最大，为0.2921%，较1.5h时提取率虽有一定的上升，但幅度很小，并无较大变化，这说明此段时间总糖虽有小部分析出，但基本全部被浸提至热水中，时间的影响在此时表现得并不明显；在进一步延长浸提时间至3h时，提取率出现下降现象，这可能是由于长时间的高温导致糖类遭受破坏所致，而且提取液颜色随着时间的延长不断加深，因而浸提时间不宜过长。由此分析可知，浸提时间对提取率有一定的影响，只要适当控制就可以在较少的时间内达到一个较为稳定的提取率。因此综合考虑能源和成本，以选择浸提时间为1.5h最为适宜。因此此时芦荟多糖最佳工艺设计为浸提温度80℃，料液比1：8浸浸提时间为1.5h。图3-4浸提时间对提取率的影响3.4正交实验数据分析对通过正交实验所得的试验数据进行分析，并且找到最佳的工艺条件，则正交实验的结果如下表3-4所示。 表3-4正交实验数据表格试验因素ABCD提取率（%）提取次数浸提温度(℃)提取时间（h）料液比(w/v)111110.2311212220.2717313330.2721421230.2796522310.2814623120.2791731320.2494832130.2737933210.2785K10.77490.76010.78390.7910K20.84010.82680.82980.8002K30.80160.83020.80290.8254k10.25830.25330.26130..2636k20.28010.27560.27660..2667k30.26720.27670.26760.01530.2751R0.02180.02340.0115优方案A2B3C2D33.5正交实验的讨论从正交试验结果中可以看出，由正交实验的k值分析，则最优的工艺条件为A2B3C2D3，即为工艺条件，提取次数为2次，提取时间为2小时，提取温度为90℃，料液比为1：10。由极差分析则对提取率的影响最大的因素为浸提温度，相对来说料比的影响相对较小，影响总糖提取率的因素主次关系为：浸提温度﹥提取次数﹥提取时间＞料液比，理论上的最佳提取工艺为：浸提温度90℃、料液比1：10、提取时间为2h，提取次数为2次。3.6验证试验3.6.1验证试验称取芦荟，并按照所选得最佳的提取工艺进行实验，设置浸提温度为90℃，浸提次数为2次，浸提时间为2h，料液比为1：10，若所得的提取率高于正交实验的最高提取率，那么说明，我们所选的实验条件为最优的。结果如表3-5所示。表3-5验证实验数据表实验编号提取率（%）10.279920.283230.2821平均提取率（%）0.28173.6.2验证试验的结论由验证试验的数据可以看出，在实验条件为，浸提温度90℃，浸提次数2次，浸提时间2h，料液比1：10时所得到的多糖平均提取率为0.28175%，高于正交时最高提取率0.2814%，说明所选取的提取工艺为最优的。3.7单因素实验对醇沉工艺的考察除了提取工艺中的各因素对提取率有影响之外，还有一些其他的条件对多糖的提取也是有影响的，醇沉工艺也对多糖的提取也是有很大的影响，所以对醇沉的工艺通过单因素实验进行进一步的优化，主要对醇沉浓度，醇沉时间，醇沉温度进行考虑。3.7.1对醇沉浓度的确定选取醇沉浓度为90%，85%，80%，70%，60%为水平进行试验，提取温度为90℃，料液比1：10，提取时间为2h，提取次数为2次，醇沉时间为4h，醇沉温度为40℃。芦荟多糖的提取率随醇沉浓度的变化如图3-6所示，，其中以60%～80%的范围内变化芦荟多糖的提取率随醇沉的浓度的增大而增，之后则为很缓慢，这可能是由于浓度过高而导致一些化学反应。根据以上的结果，采取85%的醇沉浓度做为最佳提取的条件，由于80%的提取率和85%并没有相差很多，而且考虑经济和资源的条件，确定最佳的醇沉浓度80%醇沉。图3-5醇沉浓度对提取率的影响3.7.2醇沉时间对提取率的影响选取时间为1h，4h，5h，6h，7h为水平进行实验，浸提温度为90℃，料液比1：10，提取时间为2h，提取次数为2次，醇沉浓度为80%，醇沉温度为40℃。由图可知醇沉时间在1～6h之内，提取率随着醇沉时间的增加而增加，然而当醇沉时间超过6h时，提取率有下降的趋势，可能是醇和芦荟当中的多糖反应的原因。所以醇沉的浓度也不宜过长，最佳的醇沉浓度为6h.图3-7醇沉时间对提取率的影响3.7.3醇沉温度对提取率的影响选取醇沉温度为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，浸提温度为90℃，提取次数为2次，浸提时间为2h，料液比为1：10，醇沉浓度为80%，醇沉时间为4h.由图可以看出，随着温度的变化，提取率也在不停地波动，但是我们会发现提取率的上下波动并不大，提取率最小为0.2677%，最大为0.2745%，所以，为了节约能源，也为了实验的简单易行，综合一些实际的因素，我们把醇沉的温度定为室温。图3-8醇沉温度提取率的影响图3-8醇沉温度提取率的影响3.8单因素实验结论通过单因素实验确定的醇沉工艺的最佳提取条件为，醇沉浓度为80%，醇沉时间为6h，醇沉温度为室温。第四章芦荟皮渣，芦荟全株，芦荟凝胶的多糖含量比较4.1预处理把芦荟的皮渣和芦荟的果肉分离，分离之后进行称取，再放入组织捣碎机中捣碎，之后按照全株的提取方法进行芦荟的多糖的提取。4.2实验条件的确定选取浸提温度为90℃，提取次数为2次，提取时间为2h，料液比为1：10，醇沉浓度为80%，醇沉时间为6h，醇沉温度为室温，进行芦荟的皮渣，芦荟的凝胶，芦荟的全株的多糖提取。表3-6芦荟个部位的提取率的比较实验项目提取率（%）芦荟的皮渣0.4162芦荟的凝胶0.1371芦荟的全株0.2781第五章结论与展望5.1结论经过单因素实验，并通过四因素三水平的正交实验，我们最终确定了库拉索芦荟全株的多糖的提取工艺条件为提取次数为2次，提取时间为2h，料也比为1：10，浸提温度为90℃，醇沉浓度为80%，醇沉时间为6h，醇沉温度为室温。对芦荟的皮渣，芦荟的果肉，还有芦荟全株进行比较，实验结果显示，芦荟叶的多糖的提取率为0.4162%，汁液的提取率为0.1371%，芦荟的提取率为0.2781%。5.2展望随着芦荟产业的发展，芦荟的凝胶得到了很好的利用，芦荟的皮渣并没有很大的利用，而对芦荟皮渣中的多糖进行提取，也给了我们一个很好的方向，这样可以更好的利用芦荟的皮渣，也给多糖的来源提供了一个新的出口。而且，本文通过对芦荟多糖的提取工艺的优化，也可以为我们以后的多糖的工业化生产提供更多的工艺参数。也可以为今后的研究提供一些参考。

致谢在论文完成之际，衷心感谢的感谢我的指导教师张凤清老师，从论文题目的选定到实验方案的确定到论文的修改，都是张老师的悉心指导，并且耐心的讲解，让我学到了许多的知识，张老师严谨的治学态度，踏实的工作作风和饱满的科研热情深深的感染了我，让我学到了许多的知识。她渊博的科学知识，丰富的研究经验、独到的科研方法和卓越的学术见解使我钦佩不已，从老师身上学到了对待科学的敬业精神、对待实践的认真态度和对待困难的顽强意志，令我受益匪浅，这必将成为我日后工作与学习的宝贵财富。能够和张老师做实验真是我明智的选择，也是我的幸运。在实验过程中，张老师更是耐心的知道，对实验的原理，对实验的过程多次悉心指导，同时也会让我自己进行独立思考，也培养了我许多独立分析问题和解决问题的能力。再此向张老师表示无限的敬意！再此论文过程中还要特别感谢解丛林老师，曾多次悉心指导，并且想我讲解，还提供给了我们许多实验的药品和实验器具，特此向解老师表示我衷心的谢意，也很感谢老师在生活中对我们的关心，再此还要特别的感谢我的研究生师兄师姐，特别是牛春颖学姐在论文的过程中给我们提供了很多的帮助，为我解答了许多的问题，师兄师姐的认真的只需态度也深深的感染了我，使我对实验有了更多的热情。再次向老师和各位师兄师姐致谢！再次感谢我的同组同学，王阳同学和杨祈福同学，在实验的过程中帮了我很多的忙，在撰写论文过程也帮了我许多，衷心的感谢你们！再次感谢我的母校长春工业大学，它不仅是我顺利毕业，而且还结识了五湖四海的同学并教会我许多珍贵的道理！谨对所有给予我指导和帮助的老师、同学和朋友们表示最真诚的感谢。他们无私的帮助给予了我支持，他们热情的面孔给予我鼓励。我深深地祝福他们！最后感谢我的家人，谢谢你们对我的支持和鼓励，我会更加加努力的！

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