生物显微技术：有关于免疫细胞化学和免疫组织化学

第一节免疫组织化学概述应用免疫学及组织化学原理，对细胞标本或组织切片中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)或免疫组织化学技术(immunohistochemistry)。一、免疫组化技术的基本原理和分类免疫组化利用抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。分类1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常用的方法。二、免疫组织化学的发展年代研究者事件1941年Coons实用免疫荧光技术1948年Fagraeus进一步发展实用免疫荧光技术1970年Sternberger抗体酶标记技术1974年Taylor证实组织中的浆细胞免疫组化1975年Kohler和Milstein单克隆抗体技术1981年HsuABC法90年代以来SP法，原位杂交及原位PCR免疫组化三、免疫组化技术的优点1、特异性强

抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示。2、敏感性高

起始阶段，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合。3、定位准确、形态与功能相结合

该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。四、免疫组化技术的应用由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机地结合在一起，所以，这门新技术已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域。在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更为重要。以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。近年来，伴随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。1、确定细胞类型2、辨认细胞产物3、了解分化程度4、鉴定病变性质5、发现微小转移灶6、探讨肿瘤起源或分化表型7、确定肿瘤分期8、指导治疗和预后9、辅助疾病诊断和分类10、寻找感染病因五、免疫组织化学技术基本过程（一）选择抗体抗体的选择是开展免疫组化最重要环节之一。理想的抗体应具备特异性强、敏感性高和适应性强的特点。现实市场销售的一抗多为即用型，对抗体的滴度无须摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出最佳的工作滴度。灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒是最为理想也是免疫组化染色优劣的关键，根据免疫组化技术发展至今第三代SP试剂盒更优于其它试剂盒(ABC、PAP等)。但应注意检测系统应与一抗来源相匹配，否则检不出目的物。（1）抗体选用：一般来讲，多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定；但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1∶100~1000之间，适应性强，有部分多抗表达抗原特异性较好。单克隆抗体的抗原专一性强，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1∶50~100。因此，应根据实际需要选择合适的抗体。（2）抗体分装：购入的抗体（除非只够数次用量）一般需要分装在多个安瓿中，根据月需要量，大致每安瓿含5~20微升。除留下一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存（-20℃以下）。用一支取一支，以免长期保存在4℃冰箱内失效。（二）组织处理

1、组织及时取材和固定

组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，可有效防止组织自溶坏死，抗原丢失，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内。组织块大小要适中，一般在2.5cm×2.5cm×0.2cm。对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但很难做到这一点，10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24h。2、组织脱水、透明、浸蜡

组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水1h×3次，二甲苯透明1h×2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65℃。

（三）切片组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长，有些抗原要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当处理，必须在清洗干净的玻片上进行粘合剂的处理以防脱片。1、Poly-L-Lysine(多聚左旋赖氨酸)

2、明胶硫酸铬钾法

将2.5g明胶加热溶于500ml蒸馏水中，完全溶解冷却后加入0.25g硫酸铬钾搅匀充分溶解即可使用。方法是将玻片浸泡其中2min，取出控尽液体入温箱中烤干备用。此法价格便宜、方法简单，任何实验都可以使用，特别适用于大批量的使用，但应注意，如果液体变蓝或粘稠状停用。3、APES(3-氨丙基-乙氧基甲硅烷)

切片必须保持切片刀锐利，切片要薄而平整、无皱摺、无刀痕，如有上述问题的切片在进行免疫组化染色都将出现假阳性现象，切片厚度一般为3~4μm，切好的切片在60℃温箱中过夜，注意烤片的温度不宜过高，否则易使组织细胞结构破坏，而产生抗原标记定位弥漫现象。（四）抗原修复

经甲醛固定的部分组织细胞，可使免疫组化标记敏感性明显降低，这是因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，在染色时，有些抗原需先进行修复或暴露。因此抗原修复主要用于福尔马林或多聚甲醛固定的石蜡包埋组织切片。1、抗原热修复是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（2）煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织片加热10~15分钟。（3）微波热修复微波加热法

将切片放入修复液中微波加热使温度在96℃左右，计时l0min，在微波炉中停留2min，室温自然冷却，PBS洗3min×3次。适用的抗原有：AR、Bax、Bcl-2、C-fos、X-jun、C-kit、C-myc、E-cadherin、ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshockprotein、HPV、Ki-67、MDMZ、p53、p34、p16、p15、P-glycoprotein、PKC、PR、PCNA、ras、Rb和TopoismeraseⅡ等。2、酶消化方法（1）胰蛋白酶(Trpsin)

主要用于细胞内抗原的修复。一般使用浓度为0.1%，37℃作用10min。（2）胃蛋白酶(Pepsin)

主要用于细胞间质或基底膜抗原的修复。一般浓度为0.4%，37℃作用30min。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、GFAP、LCA和LN等。（五）免疫组化染色第二节几种常用的免疫组织化学方法一、免疫荧光方法原理：是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。操作：参见书常用的荧光素有：①异硫氰酸荧光素（fluoreceinisothiocyante，FITC），为黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，有两种异构体，易溶于水和酒精等溶剂，分子量为389，最大吸收光谱为490～495urn，最大发射光谱为520～530urn，呈现明亮的黄绿色荧光，是最常用的标记抗体的荧光素。②四甲基异氰酸罗达明（tetrametrylrhodarnineisothiocyante，TRITC）是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明（rhodamine）的衍生物。最大吸收光谱550urn，最大发射光谱620urn,呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明，常用于双标记染色。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。荧光标本不能长期保存以及需要价格昂贵的荧光显微镜才能观察的问题。

注意事项（１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。（2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会导致假阴性的出现。低稀释度的荧光抗体使结果较易观察，但会带来非特异性的着色，甚至出现假阳性的结果。（3）非特异荧光的消除。非特异性荧光的消除方法较多。一般而言，冰冻切片的非特异性荧光较强，石蜡切片的非特异性荧光较弱。常用的方法有①先用非免疫血清如10％牛血清等处理切片，然后再行荧光染色。②用小鼠相应组织的干粉吸收荧光抗体中的非特异性成分。③选择合适的稀释度和切片。④选用高特异性和高效价的荧光抗体。（4）洗涤要彻底。每道程序都有用蒸馏水或缓冲液洗涤以清除残留在切片中的试剂，以达到特异着色的目的。洗涤时不论是冲洗还是振荡洗涤，其基本原则是要达到洗涤干净的目的，或者说充分稀释上一道程序中的试剂，使其含量降至最低。一般只要有足够的时间，以静置延长每次洗涤时间为宜，这是防止脱片的较好办法。洗涤液的PH值应为7.2~7.4之间，过高过低的不利于染色过程，尤其是在偏碱的PH值条件下。（5）孵育时间与温度。免疫荧光法一般孵育温度在37℃，时间为20-30分钟时是最佳时间与温度。当然，也与抗体的效价，组织抗原的含量与部位，切片的厚度等有关。二、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。用于标记的酶应具备以下六点：1、酶催化的底物必需是特异的，而且容易被显示，即催化反应所形成的产物易于在光镜和电镜下观察。2、酶反应的终产物所形成的沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，而影响组织学定位。3、较易获得纯的酶分子。4、中性PH值时，酶分子应稳定。5、在酶标过程中，酶连接在抗体上，不能影响二者的活性。6、被检组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似的物质，否则结果将难以判定。

上述六点中以1．2两点最为重要符合上述要求的，最为常用的酶是辣根过氧化物酶（Horseradish

Peroxidase，HRP）。其次是碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AKP），除此两种外，还有葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，GOD）等，但因其形成的不溶性色素扩散作用较大，在应用上受到很大限制。HRP广泛分布于植物界，因其辣根含量最高而得名。它是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白（糖占18％左右），分子量为40，000道尔顿，等电点3～9，最适PH为5.0左右。HRP易溶于水和58％以下的饱和硫酸铵溶液，其活性部分为铁卟啉，称辅基。酶的蛋白部分无活性。酶蛋白和铁卟啉辅基的最大吸收光谱分别为275nm和403nm；一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。对于纯度低，质量差的酶，需经纯化后才能使用。HRP的底物是H2O2，在分解过程中，与H2O2形成初级复合物，无电子供体存在时，反应不再继续进行，当电子供体存在时，反应以一定的速度形成第二种复合物，继之HRP催化H2O2所形成的中间型产物，迅速生成水，酶被还原，电子供氢体被氧化，聚合，再经氧化环化，最后形成吲哚胺多聚体，于酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰，达到定位、定性、定量的目的。AKP是一种磷酸酶的水解酶，磷酸单酯酶对于连接于作用物磷酸基上的醇基没有特异性，因它可以水解多种有机磷酸酯，生成醇和磷酸盐离子。该酶在许多人体组织或动物组织中有分布，如肝、胎盘、白细胞、肾、小肠等。AKP的分子量为80KD，最适PH为9.8，其活性受底物及浓度、缓冲液及其离子浓度等因素影响，如用二乙醇胺缓冲液（1mol／L，PH9．8）对AICI’具有活化作用，酶的活性高，而用甘氨酸一NaOH缓冲液则对AKP有抑制作用。AKP的活化剂有镁和锰离子，Mg++的适应浓度为10mol/L。甘氨酸、柠檬酸盐，EDTA等对AKP有抑制作用。AKP对温度具有较高的敏感性，从25℃增加到35℃，其催化反应速度增加1.5倍。当选用不同的底物时，AKP可催化形成不同颜色的终产物。例如，萘酚一AS一MX和快蓝（Fastblue，Fh）为底物时生成蓝色产物，可与HRP催化的产物形成鲜明的对比，用快红（Fastred）代替快蓝则生成红色不溶性产物，而且内源性AKP较易清除，可以较好地避免内源性酶的干扰，使其具备了某些独特的优点而日益备受重视。免疫酶法与免疫荧光法大致相同，也可以分为以下几种。1、直接法：简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低。其缺点是，每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物，且敏感性较间接法低。2、间接法：用一种酶标抗体就可与多种特异性一抗配合而检查多种抗原，而且敏感性也优于直接法。

3、酶桥法：酶桥法的建立是免疫酶法重大改进的标志。将用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改进为用酶和酶抗体免疫反应而结合的方法，避免了由于化学反应过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。其基本原理是用酶免疫动物，制备高效价、特异性强的抗酶抗体，然后用第二抗体作桥，将抗酶抗体和特异性的第一抗体（即连结在组织抗原上的抗体）连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经过酶催化底物的显色反应后，显示出抗原所在的部位及含量。

作为桥的第二抗体（即桥抗）必须对特异性抗体（一抗）和酶抗体都具有特异性，这样才能将二者相连起来，因此，一抗和酶抗体应由同一种属动物产生。酶桥法较好地保护了抗体和酶的活性，但：①在抗酶抗体的抗血清中，含有低亲和力和高亲和力两类抗体，它们作为抗原与抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲和力，而与其本身对酶的亲和力无关，故两者均可被连接在桥抗体上，由于低亲和力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使部分酶丢失，从而降低了方法的敏感性。②抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但却不能与酶结合，这样影响了组织抗原的显示。70年代初，Sternberg在各种标记抗体法和酶桥法的基础上，建立了PAP法，并加以改良，成为应用最为广泛的免疫组织化学技术之一。4、PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶法）与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是：将酶和抗酶抗体制成复合物（PAP）以代替酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，将两个步骤合并为一个步骤。PAP复合物五角形环状结构，异常稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了敏感性，Petrali等报告，PAP法比酶桥法灵敏度高20倍。PAP法应用广泛，其主要优点为：①最大限度地保存了抗体活性。因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶标记，避免了标记过程中对抗体活性的损害。②灵敏度高。由于是多层抗原抗体反应，由于免疫放大作用，使得结合在抗原抗体复合物上的酶分子增多，并且PAP法复合物性质结构稳定，这样与酶底物反应后的呈色反应增强，使微量的或抗原性弱的抗原显示出来，提高了灵敏度。③背景淡。PAP法中，连接抗体中即使存在着非特异性抗体，因其不是抗IgG的特异性抗体，故不能与抗HRP抗体相结合，也就不能把PAP复合物连接在非特异性抗体上。PAP法的不足之处是PAP的制备较为复杂。5、注意事项（1）免疫酶最适宜进行石蜡切片的染色。对保存时间较久的石蜡标本或在制作石蜡块的过程中抗原成分丢失或被封闭的组织，酶的消化是非常重要的。

（2）除直接法，特别是酶桥法和双PAP法，由于步骤较多，每步骤间的冲洗就显得非常重要，常常是导致染色失败或结果不理想的主要原因。

（3）各级抗体的稀释度是染色成败的关键。一般而言，特异性一抗的稀释度应尽可能高，桥抗体的浓度要足够，酶标抗体或抗酶抗体的稀释度要适中。（4）用HRP作为标记酶，要注意封闭内源性的HRP的干扰，若封闭效果不理想，也可以将H2O2甲醇作用于切片的步骤移至特异性的抗体孵育之后进行，或两次封闭，即切片消化之后和加桥抗体之前。三、亲和免疫组织化学技术亲和免疫组织化学技术（affinityimmunhistoichemistry）是一种将亲和细胞化学和免疫细胞化学结合起来的技术。亲和细胞化学（affinitycytochemistry）是一种利用两种物质之间高度亲和能力而相互结合的化学反应。亲和物质往往是一些有双价或多价结合能力的物质，可与多种物质结合而形成复合物，不但亲和物质之间有高度亲和力，而且与可作为标记物的荧光素、酶、同位素以及铁蛋白、胶体金等结合，从而可利用显微镜来进行观察，这种亲和反应一方面不同于组织化学反应中的分解、置换、氧化与还原，另一方面也不是抗原抗体的免疫反应。因此，Bayer（1976）首次将之称为亲和组织化学。

1、卵蛋白和生物素免疫染色卵白素（Avidin），鸡蛋白中含有的一种碱性蛋白质，与生物素（又称维生素H）以及其他物质（例如荧光素和酶）具有很高的亲和力。生物素（维生素H，Biotin）是Kogl等（1936）首先从鸡蛋黄中分离出来的。以辅酶的形式参与各种羟化酶反应。不论生物素还是卵白素均能与酶（过氧化物）结合并不影响酶的活性，这样就将亲和化学和免疫细胞化学结合起来而形成卵白素-生物素免疫染色技术。亲合组织化学技术引入免疫细胞化学后使其敏感性进一步提高，更利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的检测。目前已经建立的方法（1）标记卵白素-生物素（Labeledavidinbiotin,LAB）技术，是将活化的生物素（即利用生物素的羧基加以化学修饰后的可制成各种基团的衍生物）和免疫球蛋白等共价偶联后，加入与荧光或过氧化物酶结合的卵白素，利用生物素和卵白素的亲和结合，显示生物素偶联的物质（即抗原）。（2）桥式卵白素---生物素（bridgedavidinbiotinBRAB）技术，是利用卵白素作为桥梁，连接生物素偶联物质和生物素化的过氧化酶，而显示于生物素偶联的物质。上述两种方法均须以生物素标记第一抗体（即特异性抗体），应用有一定的困难和局限。（3）卵白素—生物素---过氧化物酶复合物（Avidin-biotinperoxidasecomplex,ABC）技术2、ABC法

抗生物素蛋白（卵白素）-生物素-过氧化物酶复合物法ABC法是Hsu等于1981年在BRAB法和LAB法的基础上改良的。其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。ABC法的优点是：敏感性强，特异性强，背景染色淡，方法简单，节约时间，并且由于生物素与抗生物素具有和多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重免疫染色。操作步骤1、4%多聚甲醛常规灌注固定，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中过夜。蜡块制作。切片，贴片。0.01MKPBS清洗5min×3后；2、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；3、加入配好的0.3%TritonX100（30%TritonX100+0.01MKPBS100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MKPBS清洗5min×3；4、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+叠氮纳0.08g）稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MKPBS洗5min×3；5、加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MKPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。3、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）该法由于用链霉亲和素替代ABC法中的亲和素—生物素复合物，因此背景清晰，敏感性增加，无非特异性染色，阳性反应易于辨认。在操作步骤中，与SABC法相比，仅有一个步骤不同，即试剂盒中的链霉菌抗生物素—过氧化物酶替代了亲和素—生物素—过氧化物酶。SP法因为灵敏度高、背景低等优点，是目前免疫组化首选方法之一。操作步骤A脱蜡、梯度酒精脱水；B灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2常温下避光孵育10min，PBS冲洗3次×3min；C抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（微波炉可高火4次×6min），自然冷却30min以上，至室温后PBS冲洗3次×3min；D封闭：用封闭液（一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液）封闭，常温下10~30min，倾去勿洗。E一抗孵育：滴加适宜浓度的一抗4℃冰箱孵育过夜（最常用），37℃复温45min，PBS冲洗5次×3min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；F二抗孵育：滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min,PBS冲洗5次×3min；GSP反应：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗5次×3min；HDAB显色：配置DAB/H2O2反应液孵育组织切片，镜下控制染色，一般3~10min，自来水充分冲洗；I苏木素复染：一般胞浆蛋白或胞膜蛋白可以适当染至几十秒~几分钟，但细胞核蛋白在几秒。若过染，可以用1%HCl褪色；J常规脱水、透明、封片。四、免疫金银法免疫金银法（Immurogold-slivermethod,IGSM）或称免疫金银染色（Immurogold-sliverstaining,IGSS）是一种新的免疫组织化学技术，近年来又不断改进，已成为最为灵敏而又经济的方法之一。免疫金银法实际上是在免疫金法的基础之上发展形成。利用胶体金作为标记物。胶体金系指金的水溶胶，溶胶是一种物质以大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系，被分散的物质叫分散相，容纳分散相的物质叫分散介质。按分散相离子的大小可将分散体系分为三种，相分散体系（分散相粒子直径大于10nm）；胶体分散体系（分散相粒子直径在1~100nm之间）；低分子-离子分散体系（分散相粒子直径〈1nm〉。胶体金属于胶体分散体系，是指金以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶。溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色，对同一种物质的溶胶而言，粒子大小不同，颜色也不同。若粒子为20-40nm的金溶胶，因主要吸收波长为530nm的绿光而呈深红色，60nm的金溶胶因主要吸收波长为600nm的橙黄色光而呈紫蓝色。在光镜水平应用的胶体金粒直径不能小于10nm，否则无可见的红色。免疫金法是将用胶体金（直径>20nm）标记的间接抗体或A蛋白再与特异性抗体结合，在光镜下就可见红色的反应物出现，不需进行呈色反应。但该法要求金标抗体浓度高，因此，价格昂贵，既不经济同时也不够敏感。免疫金银染色（IGSS）是在免疫金染色的基础上，在对苯二酚存在的情况下，通过含银离子的显影液中的还原反应，使在抗原抗体反应部位的金粒子周围形成很多沉淀层，光镜下就可看到阳性反应部位呈清晰的棕黑色，从而显示不易被光镜定位的金粒，显示出组织中抗原的部位。这种方法不仅提高灵敏度，同时金标记抗体可以稀释10倍以上后应用，此外还可避免使用具有致癌危险的有机色素。IGSS法的主要优点是：（1）敏感性高。与其他的免疫组织化学技术相比，IGSS法被认为是最敏感的方法，尤其适合于只含微量抗原的组织标本。（2）应用范围广。IGSS法不仅可以在冰冻切片，细胞涂片以及培养细胞、石蜡切片上进行光镜观察，而且还能应用于树脂包埋的切片的电镜观察，并且能准确定位抗原。（3）定位准确。IGSS法的银颗粒沉积在抗原抗体反应部位，一般无扩散，定位较为准确。（4）方法简便、安全、成本低、经济、同时标本也可以长期保存。（5）用醋酸银代替硝酸银和乳酸银，不仅保持了原有方法的敏感性、特异性、低背景、对比度好的特点，而且整个显影过程可以在常光下进行，从而弥补了在暗室显色的不足。

IGSS法的主要问题是非特异性背景，由于其非特异性背影染色影响了IGSS法在常规免疫组织化学鉴别诊断上的应用。

复习题简述免疫组化技术的基本原理免疫组化技术的优点免疫组化技术适合检测组织细胞中的哪些成分？免疫组化实验时选择第一抗体时要注意哪些？与普通石蜡切片制作技术相比，制作免疫组化切片时固定、脱水、透明、包埋等环节应注意什么问题？为什么要进行抗原修复，修复的方法有哪些？为防止脱片，常用的粘片剂有哪些？简述PAP法的原理。简述ABC法和SP法的实验原理和流程？第三节免疫组化过程中的注意事项一、制片过程（一）为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。（二）组织脱水必须彻底干净（三）、切片必须完整、均匀、平展、无皱折（四）切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。（五）切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。（六）切片脱蜡必须干净，否则将会影响免疫组化染色的最后结果。二、缓冲液免疫组化染色标记是对生物体组织抗原进行标记，抗原抗体最适合的pH值为7.2~7.6，最常用的是0.0lmol/LpH7.4磷酸缓冲液(PBS)。简易配法：5000ml蒸馏水中分别加入lgNaH2PO4、15.6gNa2HPO4、42.5gNaCl。但如果是采用碱性磷酸酶(AP)作为标记物底物的方法时可以用0.02mol/LTBSpH8.2缓冲液比较好。三、注意抗原修复为什么进行抗原修复抗原修复方法可分为化学方法和物理方法。化学方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶常用的物理方法有单纯加热、微波处理和高压加热。HIER对大多数的抗体有益，尤其是对核抗原的修复作用更加明显，最常用的抗原修复液是pH6.0的枸橼酸缓冲液和pH8.0的EDTA缓冲液抗原修复，必须注意以下问题：1、PH值的应用范围及选择。2、抗原修复时应选择最佳温度。3、抗原修复时有效温度所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间也不一样。4、抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。5、尽量使用足量的抗原修复液。6、切片必须附贴牢固。四、去除内源酶及内源性生物素，降低背景的染色1、去除内源酶常用的去除内源性酶的方法是3%过氧化氢水溶液。最好室温10min。2、去除内源性生物素采用生物素方法染色前也可以将组织切片进行0.01%卵白素溶液室温处理20min。3、灭活碱性磷酸酶最常用的方法是将左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值为7.6~8.2，能除去大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。五、适当合理地使用封闭试剂，减少背景产生的非特异性染色为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色一般常见实用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室温下作用10~30min即可，但应注意此种结合是不牢固结合，所以最好不要冲洗，倾去余液直接加一抗，对于多克隆抗体来讲，易产生背景着色，在稀释特异性抗体时可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。六、选择合适的抗体1、按使用方便可分为两种类型1）浓缩型抗体①可作为各种疾病检测的常备抗体。②成本低，价格较便宜。③需要稀释抗体，手续较为复杂。④需要配置各型号的微量加样器，以利于量取精确的抗体量。⑤需要具备一定的英语水平2）即用型抗体。①使用方便。②对于不具备或基本不懂免疫组化技术的人，只要按照说明书的方法使用，也能获得理想的结果。③不需要配置多种昂贵的微量加样器。④特别适合于基层单位。⑤价格较浓缩型抗体贵。⑥即用型抗体不可作为常备贮存抗体。2、按的实际使用范围，把抗体分为两个类：1）适合于冰冻切片，涂片，细胞培养片。2）适合于石蜡切片，冰冻切片，涂片和细胞培养片。3、选择合适的单克隆或多克隆抗体。多抗和单抗特性比较：（1）均一性。单抗是一种纯度很高的均一抗体。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。（2）稳定性。单抗的稳定较差，而多抗的稳定性则较好。（3）特异性。单抗特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。（4）重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。（5）沉淀反应：多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。4、抗体的加入注意以下问题1）当PBS冲洗完毕后，在加入抗体，如一抗，二抗或三抗，必须将存留于切片上的多余的PBS摔干，但不能让切片干涸2）加入的抗体以一滴为佳。3）切片没擦好将会影响加入抗体的质量，正确的做法就是彻底地用PBS冲洗，摔干切片擦干切片周边的PBS，再滴入一滴抗体轻轻摇匀即可。5、抗体的保存抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。七、选择合适的孵育时间。孵育必须在湿盒内进行。第一抗体的孵育时间，有较多的使用范围，应用于临床检测抗体的孵育时间。一般室温下孵育在30-60分钟，120分钟，对于研究性质的抗体孵育时间，也可按照上述的时间，但也有人提出于4℃冰箱中过夜孵育，有人不主张于4℃冰箱中过夜八、连接抗体的选用必须正确，否则可造成假阴性的现象。第一抗体有单克和多克隆之分，连接抗体则要根据选用的抗体来进行，例如：第一抗体选用的是单克隆鼠抗人**抗体，连接抗体也要选择相应的兔抗鼠IgG，这样才能连接上九、复合物的使用及孵育时间的确定。各种方法有各自的复合物，如ABC法，复合物是卵白素和生物素结合的复合物，再带有HRP，SP法，（LsAB法）的复合物是链霉菌素蛋白复合物，再带有HRP。除此之外，根据水解底物的不同，可产生不同的颜色，例如：带有HRP的酶，水解的底物一般为DAB产生黄棕色，带AKP的酶，水解的底物一般为AEC产生红色。

十、PBS的冲洗1、单独冲洗，防止交叉反应造成污染。

2、温柔冲洗，防止切片的脱落。3、冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。

4、PBS的PH和离子强度的使用和要求。十一、显色免疫组化染色的显色是最后的关键问题一般辣根过氧化物酶(HRP)的检测系统选用DAB或AEC显色系统进行显色。但要得到最佳的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到最强显色而背景无色为最终点如果是碱性磷酸酶(AP)最好选用NBT/BCIP作为显色系统（结果染为蓝黑色）。1、DAB显色系统：二氨基联苯胺（3,3′-Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（WB)、免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)、斑点印迹(Dotblot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。二氨基联苯胺染色试剂盒（DABStainingKit）为25倍（25X）浓缩液，采用特殊配方，灵敏度高，背景低，储存稳定，使用方便。保存条件：试剂盒应在-20℃，避光、密封保存。注意事项：1）DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用；

2）显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或浅棕色，如颜色过深，请勿使用；

3）DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染；

4）DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。2、AEC显色系统：AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）是辣根过氧化物酶（HRP）的生色底物。在过氧化物酶的催化下，电子供体AEC在过氧化氢氧化下，生成稳定的红色产物。该红色产物不溶于水，但溶解于有机溶剂。适用于HRP系统的IHC和WesternBlot实验的酶促显色。3、NBT/BCIP显色系统：NBT/BCIP(NitroblueTetrazolium/5-Bromo-4-chloro-3-IndolylPhosphate)是一种用于Northern印迹实验、Southern印迹实验、蛋白质印迹实验(Westernblot)、原位杂交(Insituhybridization)、免疫组化实验过程的单组分溶液。该试剂是特别用于碱性磷酸酶系统的试剂。NBT/BCIP产生一种可溶于乙醇的紫色反应产物。4、光镜控制显色方法（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温最宜5分钟。（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。十二、对照片的设置（1）空白对照（阴性对照）：第一抗体由PBS或非免疫血清取代。（2）阳性对照：用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。（3）回收实验阴性对照：已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。（4）替代对照：用于第一抗体同种动物的血清或无关抗体代替第一抗体结果为阴性。（5）自身对照：在同一切片上，应将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。十三、对照组和染色结果的评价1、阳性染色特点 ①Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）IHC中常见的抗原表达模式有以下几种：a.细胞浆内弥漫性分布，多数胞浆型抗体的反应如此，如细胞角蛋白（cytokeratin，CK）和波形蛋白（vimentin）等；b.细胞核周的胞浆内分布，其判别要点是细胞核的轮廓被勾画得很清楚，如CD3多克隆抗体的染色；c.胞浆内局限性点状阳性，如CDl5抗体的染色；d.细胞膜线性阳性，大多数淋巴细胞标记的染色如此，如CD20、CD45RO；e.细胞核阳性，如Ki-67及雌、孕激素受体蛋白ER、PR等。一种抗体可同时出现细胞浆和细胞膜的阳性表达，如EMA可呈膜性和胞浆内弥漫性阳性反应；CD30抗体②染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色弥散性均匀）

2、组织切片制作过程的影响①固定不良—非特异性染色，显示不均。②边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。3、人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。阳性对照：用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。阴性对照：用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。一切的判定方法都是力求使免疫组化染色结果判断更标准，但各单位采取的标准不尽相同，所以判断标准化问题还有待长期实践中病理学术界商讨判定标准。一是以检测结果阳性细胞指数来定性(如核抗原的标记)，判断方法是以一个视野中的阳性细胞数与总细胞的百分比，再取10个相同视野算取平均指数；另一种方法以染色阳性强度和阳性检出率相结合而定，一般阳性细胞数在0~25为阴性，25~50为十，50~75为十十，75以上为十十十。此种判定方法容易出现人为误差现象。有条件的实验室最好能用图像分析系统进行结果检测定量分析更为准确。假阳性反应可发生在：①抗体与非待检抗原发生交叉反应，在使用多克隆抗体时易出现；②组织对抗体的非特异性吸附，特别是在有大片组织坏死或组织中有较多富于蛋白的液体时容易发生；③内源性过氧化酶的作用，在脾脏、骨髓及一些炎性病变组织的染色中易出现；内源性碱性磷酸酶的作用，特别是肠黏膜上皮和肾近曲小管的刷状缘有高浓度的碱性磷酸酶，若处理不彻底，易出现假阳性结果；④判断失误，将肿瘤组织中残留的正常组织的免疫组织化学阳性信号误认为是肿瘤的染色反应；⑤当肿瘤浸润破坏正常组织时，使被破坏的正常细胞胞浆内的可溶性蛋白释放，后者被肿瘤细胞非特异吸附或吞噬，使瘤细胞出现该种抗原的阳性反应；⑥外源性和内源性色素的干扰。假阴性反应可发生在：①组织内待测抗原已被分解破坏，或抗原含量过低；②抗原被遮盖，多由于醛类固定剂的使用，使组织中的大分子蛋白借醛键形成交联而遮盖待检抗原；③抗体质量不佳或稀释度不当；④技术操作失误等。十四、免疫组化常见问题及其解决办法1、一抗从4℃拿出后，为什么要进行37度复温？（1）一方面，防止切片从4℃直接放入PBS易脱片；（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用，4℃和37℃时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者，后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。2、切片染色后背景太深，如何区分特异性与非特异性着色？（1）抗体浓度过高（2）抗体孵育时间过长或温度较高（3）DAB变质和显色时间太长（4）组织变干（5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长（大于24小时）（6）一抗变质、质量差的多克隆抗体3、脱片产生的原因有哪些？（1）多聚赖氨酸玻片质量的问题。（2）组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。（3）没烤好，时间短，温度不够之类。（4）操作的时候甩的太猛了，有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水。（5）修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长了，或者放进100℃的修复液时手法不好，咚的一声就丢进去了，这样容易脱片。此外，用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。（6）一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用PBS的时候尽量用泡的，不要冲。4、免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么？（尤其是微波修复）5、DAB显色后发现切片着色不均匀：如一片着色，一片不着色或染色浅？（1）切出的片子厚度本身可能就不一样，切出一片厚，一片薄，这样可能造成着色深浅不一。（2）有可能是显色液底物加到片子上后没有摇匀，造成局部底物浓度不一致，所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下，使片子上所有区域的底物浓度一致。（3）如果你的片子是中间的染色深，靠近边上的浅，那有可能是你蜡圈画的太小，显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm。6、所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对照在内。全部（－）原因可能：①染色未完全严格按照操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤复染或脱水剂使用不当7、所有切片均呈阳性反应，原因可能是：①切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。②缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。④抗体温育的时间过长。⑤H2O2浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。8、所有切片背景过深，原因可能是：①未加酶消化处理切片。②切片或涂片过厚。③漂洗不够。④底物呈色反应过久。⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血。⑥使用全血清抗体稀释不够。

9、阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。最常见的原因是：标本的固定和处理不当。10、交叉反应指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。1）抗原特异性。2）共同决定簇。3）决定簇相似。十五、免疫组化双染实验流程（一）脱蜡和水化（二）第一抗体的染色（三）第二抗体的染色