血清和关节液中YKL对骨性关节炎

关于血清和关节液中YKL对骨性关节炎第1页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三一、课题简介关节软骨特性：光滑、耐磨、富有弹性及一些特有的机械性能功能：传导载荷、吸收震荡、润滑关节

第2页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三

由于关节软骨没有血管、神经，一旦损伤，很难自我修复(oncedestoryed，isnotrepaired)第3页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三Alginate实验流程图第4页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三谢谢！第5页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三前言关节软骨是一种高度分化的组织，由于缺乏血供，损伤后很难自我修复（oncedestoryed，isnotrepaired）

第6页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三AutologousChondrocyteTransplantation（ACT）1994年，Brittberg第7页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三谢谢第8页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三国内外曾用多种修复方法来治疗软骨损伤，如刨削成形术、微骨折术、软骨下骨钻孔术等，其基本原理是利用生物或机械因素使骨髓中的多能干细胞到达软骨缺损区，并进一步分化为软骨及骨组织。研究发现形成的软骨为纤维软骨或类透明软骨，且该软骨容易发生退变。第9页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三谢谢第10页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三本研究所属领域范围及性质骨性关节炎(osteoarthritis,OA)生物学标志物(Biomarkers,BiologicalMarkers<Mesh>,marker.BM)的研究领域。采用横断面研究的方法,对OA体液中生物学标志物之一—YKL-40(又称人软骨糖蛋白-39,humancartilageglycoprtein-39,HCgp-39/GP-39)进行的临床诊断性试验研究。第11页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA概况(1)OA是引起关节疼痛和活动受限的常见病变,是世界性的关节疾病。在美国50岁以上的人群中已成为劳动力丧失的第二大疾患。在我国OA的发病率:农村为9.6%,城市人群为4.9%。第12页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA概况(2)OA是以疼痛、肿胀、活动受限、弹响，有时伴关节积液，以及不同程度的局部炎症,但无全身症状为特点的关节病。OA的病理生理学特点：负重部位的不规则软骨丧失；软骨下骨硬化、囊性变、边缘骨赘形成不同程度的滑膜炎症。第13页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA诊断的现状目前临床所通用的是1986年美国风湿病协会关于OA的诊断标准，主要是以症状+X线征像为依据的。现有检查手段对OA软骨退变诊断的局限性

MRIX线其征象改变比软骨发生退变迟3-5年。第14页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物(BM)(1)

----概况近年来国内外学者欲在OA患者的体液中寻找理想的病变标志物，来及时反映关节软骨代谢状态和局部病变的进展情况，揭示病情活动或预后，并为临床提供疗效评价的客观依据。美国国立卫生研究院2000年建议用Biomarker取代marker,这样可更好地揭示其生物学本质。第15页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物(BM)(2)

----研究现状大量实验研究已发现许多能反映OA病情的BM：反映骨代谢的BM；反映软骨代谢的BM；反映滑膜代谢的BM。

YKL-40：可能是反映软骨和滑膜代谢的BM之一。近年来，国外开始进行临床试验研究。第16页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物（BM）（2）

——研究现状（1）反映骨代谢的BM

合成代谢I型胶原：I型前胶原氨基端前肽,I型前胶原羧基端前肽。非胶原蛋白：骨特异性碱性磷酸酶;骨钙素。分解代谢I型胶原：脱氧吡啶酚,吡啶酚;I型胶原氨基端端肽,I型胶原羧基端端肽-1,2。非胶原蛋白：血浆酒石酸盐耐受性酸性磷酸酶,骨唾液蛋白。第17页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物（BM）（2）

——研究现状（2）反映软骨代谢的BM合成代谢Ⅱ型胶原：Ⅱ型前胶原羧基端前肽,ⅡA型前胶原氨基端前肽。可聚蛋白多糖：硫酸软骨素表位846,3B3,7D4。其它蛋白：YKL-40即人软骨糖蛋白-39分解代谢Ⅱ型胶原：吡啶酚;Ⅱ型胶原新表位COL2-3/4m,COL2-1/4N1;Ⅱ型胶原羧基端端肽。可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片断;硫酸角质素表位5D4,AN9P1;其它蛋白：软骨寡聚基质蛋白。第18页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物（BM）（2）

——研究现状（3）反映滑膜代谢的BM合成代谢I型和III型胶原：I型前胶原羧基端前肽,III型前胶原氨基端前肽。非胶原蛋白：透明质酸;YKL-40;软骨寡聚基质蛋白;基质金属蛋白酶及其组织抑制因子。分解代谢I型和III型胶原：葡萄糖-半乳糖-吡啶酚;I型胶原羧基端端肽-2。第19页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三YKL-40概况YKL-40（又称人软骨糖蛋白-39，humancartilageglycoprtein39，HCgp-39/GP-39）在非泌乳期牛的乳清分泌物中被首次发现的。来源：软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞等。相对分子量为40000的糖蛋白，含383个氨基酸。由10个外显子构成的含开放读码框架完全互补cDNA序列编译。是壳质酶(chitinase)糖蛋白家族的成员,但不具备壳质酶活性。第20页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三YKL-40的研究现状（1）目前YKL-40的相关研究主要集中于以下领域：类风湿性关节炎；骨性关节炎；巨细胞性动脉炎；肝纤维化；乳腺癌和结肠直肠癌，等等。虽然YKL-40的作用机制尚不清楚，但研究表明它与许多组织的重塑和细胞外基质降解有关。第21页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三YKL-40的研究现状（2）关节液内YKL-40是软骨细胞和滑膜细胞的分泌产物。OA患者[Volck]

：YKL-40在关节液中含量增加；血清水平也升高。Johansen报道：血清和关节液中YKL-40水平是反映滑膜炎时滑膜合成代谢水平的指标。Volk等的研究表明：YKL-40可能在OA的关节软骨降解和重塑形中也起着重要作用。第22页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三YKL-40的研究现状（3）YKL-40是一个反映滑膜和关节软骨代谢的BM?经检索十年的CBMDisc未发现国内关于YKL-40在骨性关节炎方面的研究论文发表。第23页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物（BM）（3）

——血清BM研究中的混杂因素血清BM除反映关节的病情外，还可能受其它因素的影响：生物节律的影响肠蠕动的影响体育活动的影响肝肾等疾病的影响年龄和性别的影响手术的影响药物因素的影响第24页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三OA的生物学标志物（BM）（4）

--现有临床诊断性研究论著的局限性

多以OA患者X线征象的Kellgren&Lawrence分级作为“金标准”，来对照评价OA病情严重程度。充分考虑混杂因素控制的相关论著也不多见。第25页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三本研究目的明确关节液（synovialfluid,SF）中YKL-40水平对膝OA的诊断价值；探讨血清（Serum）中YKL-40水平对膝OA的诊断价值。第26页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三本研究的特点诊断试验的“金标准”关节镜下关节软骨损伤和滑膜炎病理变化程度的评分；WOMAC骨性关节炎指数（由患者自我评估）；X线的Kellgren&Lawrence分级，负重位X线的膝关节间隙宽度。充分控制混杂因素探讨血清YKL-40诊断价值。第27页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三本研究的意义学术意义可以明确YKL-40对OA的诊断价值；可为OA的症状解释、早期诊断及其分期提供一种实验室检查手段；可为OA的治疗提供一种疗效评价的客观指标；可为进一步研究确定国人体液YKL-40的正常参考值奠定基础。经济效益近期效益；远期效益。第28页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三统计学分析X线评价体液YKL-40的检测（ELISA）体液标本的预处理和储存OA病变程度的评价术中关节镜下观察采集关节液标本采集血液标本膝关节镜手术时术前化验时病例选择关节软骨退变和滑膜炎关节镜分级关节液和血清YKL-40浓度Kellgren&Lawrence分级技术路线功能评估WOMAC指数专业结论第29页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术关键体液标本的采集和预处理体液标本的检测统计学的统计处理第30页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三研究方法（1）

——病例选择病例来源：山医二院骨科行膝关节镜检查和膝关节置换术的患者。择入标准:非发育期患者（年龄＞18岁）；排除肝肾疾病、全身感染和癌症等的患者；体液标本采集前两月未使用糖皮质激素类药物的患者。样本含量：≥60例。第31页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三研究方法（2）

——体液标本的采集、预处理、储存和检测体液标本的采集、储存前处理、储存和取用、以及检测前处理和检测，应依据课题技术规范进行。本课题相关技术规范主要参考《PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.》制定。第32页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术规范（1）

——体液标本的采集体液标本的采集规范血液标本在清晨6-8时空腹抽取静脉血5ml，留存于无菌非抗凝试管中送检。并应限制病人在采集标本前活动。关节液标本在行关节镜手术时麻醉后采集：抽取关节液原液留存于无菌非抗凝试管中（尽量多抽取）。第33页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术规范（2）

——体液标本的储存前处理

体液标本均应在采样后2小时内进行离心处理：血清标本：在至少×600g，3000rpm，10分钟的条件下离心。关节液标本：在×2500g，4℃，15分钟的条件下离心。（4500rpm，20min）第34页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术规范（3）

—体液标本的储存和取用体液标本的储存标本离心后取上清液，经快速冷冻后,-70℃条件下冻存。体液标本的取用在室温下复温解冻。标本避免反复冻融。第35页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术规范（4）

——体液标本检测前处理和检测体液标本的检测前处理关节液标本应先经离心后，取上清液测定其含量；血清标本不需进行特殊处理。体液标本的检测ELISA法。第36页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三研究方法（3）

——其它相关资料的收集临床资料一般资料；临床症状、体征；问卷调查：WOMAC指数实验室检查资料常规项目，血清Ⅳ型胶原。X线资料关节间隙的宽度；Kellgren&Lawrence分级。手术资料关节软骨损伤和滑膜炎程度的评分；手术录像资料。第37页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三技术规范（5）

——手术资料收集的注意事项手术中对关节内组织的病变程度进行评价：关节软骨损伤：Outerbridge膝关节软骨损伤评分法；滑膜炎：Ayral膝滑膜炎评分法。术中对病变部位用探钩进行相对测量，并注意留存录像资料。第38页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三研究方法（4）

—OA病变程度的对照评价标准关节组织的关节镜征象评价标准关节软骨退变程度：Outerbridge法；滑膜炎程度：Ayral膝滑膜炎评分法。OA病变程度的X线征象评价标准Kellgren&Lawrence分级；负重位的膝关节间隙宽度。OA病变程度的患者自我评估标准WOMAC骨性关节炎指数。第39页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三研究方法（5）

—统计学处理使用SPSS11.0软件进行统计学分析OA组和非OA组之间体液YKL-40水平的比较用多元协方差分析。体液YKL-40水平与关节镜下相关组织的病变程度评分之间用多元线性回归。体液YKL-40水平与膝关节间隙宽度或WOMAC评分间用相关分析。第40页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三可能遇到的问题及解决办法标本的采集、预处理和检测等的标准化严格依据课题技术规范进行，才能保证结果的有效性和可比性。混杂因素的控制探讨血清YKL-40水平对OA诊断价值的关键。第41页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三混杂因素的控制（1）生物节律影响的控制血液标本的采集在固定时间（清晨6-8时）进行。肠蠕动影响的控制血液标本在清晨空腹时采集。体育活动影响的控制采集血液标本前限制病人的体育活动。第42页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三混杂因素的控制（2）肝肾等疾病影响的控制选择肝肾功能均正常的病例；若样本含量不足时，用统计学方法进行控制。经术前检查可排除全身感染和肿瘤等的影响。年龄和性别影响的控制采用统计学方法进行控制。第43页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三混杂因素的控制（3）手术影响的控制由于体液标本是在麻醉后手术前采集的，故麻醉的影响可忽略。药物因素影响的控制采集标本前两月内未使用糖皮质激素类药物。第44页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三进度安排

2005年1月~2005年4月文献检索，课题设计，课题技术规范的制定,开题报告。2005年5月~2005年9月标本的采集和预处理，临床和手术资料的收集。2005年10月~2005年12月预实验，部分体液标本YKL-40含量的测定，分析关节液和血清YKL-40水平与膝骨性关节炎WOMAC评分和X线分级的相关性。2006年1月~2006年2月体液标本YKL-40含量的测定，分析关节液和血清YKL-40水平与膝关节镜下相关组织大体病理变化程度的相关性。2006年3月~2006年6月数据整理，统计分析，撰写论文,论文答辩。第45页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三开题条件（1）

——学术及技术条件研究人员卫小春教授长期从事关节软骨损伤的研究,具有丰富的临床经验和很强的科研能力.能及时把握国际上关节软骨损伤研究的最新进展。主持承担国家863计划一项及省部级科研项目多项，在国内外期刊上发表论文多篇。文献和技术准备已检索并熟读了大部分相关核心文献，了解该领域的研究进展、YKL-40的检测方法。病源及标本来源山医二院骨科病源充足；课题所需的体液标本较易获得。第46页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三开题条件（2）

——实验设备条件山医二院所具备的实验条件手术室：关节镜设备；骨科实验室：酶标仪及相关波长的滤光片、深低温冰箱、低速离心机、高速离心机、电热恒温孵育箱、电子天平、普通冰箱；放射科：拍片相关设备。第47页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三开题条件（3）

——经费预算

科研业务费3000元实验材料费7000元仪器设备费4000元协作费1500元科研组织费2000元合计17500元

第48页，讲稿共50页，2023年5月2日，星期三参考文献PooleR.NIHWhitePaper:Biomakers,theOsteoarthritisInitiative(ABasisforDiscussion).Ferbruary3rd,2000.MorganteM,MetelliMR,MorganteD.ObservationsontheincreasedserumlevelsofYKL-40inpatientswithrheumatoidarthritisandosteoarthritis.MinervaMed.2001;92(3):151-3.JohansenJS,OleeT,PricePA,etal.RegulationofYKL-40productionbyhumanarticularchondrocytes.ArthritisRheum.2001;44(4):826-