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第三章免疫酶组织化学技术免疫酶组织化学技术酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶.酶标记已知Ab(或Ag)+组织细胞内相应的Ag(或Ab)抗原抗体复合物(酶标)底物有色沉淀定位;图像分析仪半定量免疫组化方法酶标抗体免疫组织化学直接法间接法◆非酶标抗体免疫组织化学酶桥法PAP法、APAAP法酶标抗体免疫组织化学染色法(一)原理直接法和间接法直接法是将酶标记在第一抗体上,直接检测细胞内特异性抗原。间接法一两步法抗:是细胞组织内抗原的特异性抗体;二抗:是抗一抗的抗体,并且已用酶标记(注意:第二抗体与第一抗体须是不同种属动物制备的,因为第二抗体往往是用第一种动物的IgG所制备。)酶标抗体法-直接法原理:将酶直接标记在一抗上过氧化粉然后直接与相应抗原特异地结合。形成抗原一抗体_酶复合物,最后用底物显色剂显色第一体优点:简便、快速、特异性强非特异性背景反应低缺点:浪费抗体、敏感性极低围》1兔组化直法依靠化学连接(共价键)对酶及抗体活性有影响。每种抗原必须分别用其抗体的酶标记物。酶标抗体法-间接法二抗原理:将酶标记在二抗上,先将一抗与相应的抗原结合,形成抗过化原抗体复合物,再用二抗(酶标抗体)与复合物中的特异抗体结合,第一抗形成抗原-抗体-酶标抗体复合物最后用底物显色剂显色优点:只需一种酶标抗体即可。△△一mE块:教感性低,但优于直接法围22免疫组化国接法依靠化学连接对酶及抗体活性有影响。令免疫酶组织化学方法最终的生成物是带有酶标记的抗原抗体复合物,再依据酶与底物作用生成不溶性的有色产物沉积在抗原抗体反应原位,并借此确定该抗原的性质、存在的部位和含量。令显色反应:令酶+底物=不溶性的色素标记酶:辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶(ALP)葡萄糖氧化酶(GOD)β-D-半乳糖苷酶.1辣根过氧化物酶HRP显色:产物棕褐色HRP与底物过氧化氢和DAB作用产物棕褐色,有嗜锇性DAB性质:电子供体,较敏感,室温时较稳定,显色后切片可长期保存。可致癌,可将DAB制成10倍浓度储存液,分装后-20℃贮存注意事项:孵育时间和配置方式易产生背景着色浓缩的DAB—按照说明书;注意校正蒸馏水的PH值;粉剂DAB—溶解时滤去不溶性颗粒;现用现配保存时可产生氧化物沉积在切片上,形成斑点。临用前加H2O21辣根过氧化物酶HRP:3344492碱性磷酸酶ALP显色:产物蓝色或红色令以磷酸萘酚ASMX为底物,被ALP水解后生成萘酚AS-MX,再与孵育液内的坚牢蓝B盐或坚牢红TR盐等偶联生成不溶性染料(坚牢蓝或坚牢红)而成令优点:细胞和组织内的内源性碱性磷酸

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