化学发光、胶体金课件

第十章化学发光免疫分析技术电化学发光免疫分析3学习要点发光酶免疫分析1化学发光免疫分析2发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:

光照发光、生物发光、化学发光等。

概述光照发光（photoluminescence）：发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。生物发光（bioluminescence）：是反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在恢复到基态时多余的能量以光子形式放出。典型例子为萤火虫发光。化学发光（chemiluminescence）：指物质在化学反应过程中，其物质分子吸收化学能产生的光辐射现象。荧光素化学产物分子荧光素酶+ATP化学反应产生能量紫外光(短波<400nm)化学发光化学发光包括化学激发和发光两个步骤，其机制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子激态。当此产物分子或中间态分子衰退至基态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态。反应过程可简单地描述如下：

A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子，C*表示C处于单线激发态（一）直接化学发光

若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光。反应过程可表示如下：

A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ（二）间接化学发光该反应必须提供足够的激发能,并由某一步骤单独提供,因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光;要有有利的反应过程,使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态;激发态分子必须具有一定的化学发光量子产率，释放出光子,或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。（三）化学发光条件化学发光强度（ICL）取决于化学反应的速率（dc/dt）和反应的化学发光量子产率（ΦCL）

ICL=ΦCL×dc/dt

ΦCL=Φr×Φf

Φr:生成激发态产物的量子产率，也就是每一个参加反应的分子产生的激发态效率；

Φf:激发态产物分子的发光量子产率，也就是每一个激发态产生的光子数效率，对于一定的化学发光反应，为一定值。（四）化学发光强度化学发光免疫分析(chemiluminescence

immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。免疫反应系统、化学发光分析系统化学发光剂化学发光剂(Chemiluminescencereagent)：

在化学反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。（一）酶促反应发光剂（二）直接化学发光剂（三）电化学发光剂发光的量子产率高；物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。作为化学发光剂的条件（一）酶促反应发光剂是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。常用两种酶：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)HRP发光剂：鲁米诺及其衍生物：碱性环境H2O2参与下，产生发光反应。对-羟基苯乙酸：H2O2参与下，生成荧光物质。ALP发光剂：AMPPD：碱性环境下，产生发光反应。4-MUP：生成荧光物质。（luminol，5‘-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的化学发光1.鲁米诺〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕

AMPPD在碱性条件下，被碱性磷酸酶(ALP)酶解成相当稳定AMP-D阴离子，30min内分解，发出470nm波长持续性光，60min内保持相对稳定。2．AMPPD（二）直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。

吖啶酯需要电极表面进行电化学反应三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。（三）电化学发光剂在电极阳极表面，TPA和[RU(bpy)3]2+各失去电子，成为TPA·强还原剂和[RU(bpy)3]3+强氧化剂，TPA·将高能电子递给[RU(bpy)3]3+，使其成为激发态[RU(bpy)3]2+·，而后者不稳定，发射波长620nm光子，回复到基态[RU(bpy)3]2+。在电极持续存在情况下，上述反应周而复始发生，产生许多光子，使光信号增强，得以检测到。三联吡啶钌电化学反应

标记技术化学发光标记物：将化学发光剂与抗体或抗原结合在一起的复合物。标记方法：直接标记：过碘酸钠氧化法间接标记：N-羟基琥珀酰亚胺活化法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。过碘酸钠氧化法N-羟基琥珀酰亚胺活化法抗体或抗原分子中的羧基，与N－羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化反应，再与发光剂的氨基偶联形成酰胺键的发光标记物发光剂的选择；被标记蛋白质的性质；标记方法的选择；原料比；标记率；温度；纯化与保存。影响标记的因素：化学发光免疫分析系统类型：第一种是以酶标记抗原或抗体，通过酶促反应使底物发光，检测发光强度。第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过化学发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。第三种是以电化学发光剂标记抗原或抗体，在电极表面由电化学引发的化学发光反应。

化学发光免疫分析系统发光酶免疫分析原理：辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图

技术要点抗原抗体反应：

双抗体夹心法、双抗原夹心法、固相抗原竞争法

结合复合物分离：固相：去污缓冲液冲洗非固相：磁力分离、纤维膜柱、离心分离

酶促发光反应：

依据发射出光性质不同，用不同仪器检测

荧光检测、化学发光检测方法学评价1.酶和发光两级放大效应，灵敏度较高2.酶标抗体/抗原的非特异性吸附，高背景3.洗涤不彻底导致外源性酶污染，假阳性4.标本中对酶促反应的影响物质化学发光免疫分析原理：

用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。技术要点磁微粒技术分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测方法学评价1.吖啶酯直标抗原/抗体，稳定长久，不影响其生物活性2.反应简单、快速，背景较低3.吖啶酯为瞬间发光，持续短，信号检测要求高电化学发光免疫分析原理：电化学发光免疫分析示意图电化学发光免疫测定示意图电化学发光动画方法学评价1.光信号持续长，强度强，易检测、易控制2.标记物循环利用，灵敏度高3.标记物稳定性好，不影响抗原或抗体理化特性4.反应时间短，线性范围宽化学发光免疫技术应用

①敏感度高，甚至超过RIA；②精密度和准确性均可与RIA相比；③试剂稳定，无毒害；④测定耗时短；⑤测定项目多；⑥已发展成自动化测定系统。

1.甲状腺激素

2．生殖激素

3．垂体激素和皮质激素

4．贫血因子

5．肿瘤标志物

6．感染性疾病

7．糖尿病胰岛素、血清C-肽、血浆胰高糖素等。

8．心脏标志物

9．病毒标记物

10．过敏性疾病

11．治疗药物监测小结化学发光剂的种类化学发光剂标记物制备化学发光免疫分析类型及各自原理、方法评价第十一章胶体金免疫技术临床免疫检验教研室学习要点胶体金免疫组织化学技术3胶体金与免疫金1胶体金免疫测定技术2胶体金胶体金免疫技术(Colloidalgoldimmunoassay),是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。胶体金为媒介，体现抗原抗体反应

胶体金(Colloidalgold)：金盐被还原成金原子后的悬液，静电作用下，金颗粒间相互排斥而悬浮成稳定的胶体状态。特性：大小：1~100nm，均一性，胶体

呈色性与光吸收性：与颗粒大小有关

稳定性：受电解质、浓度、温度、稳定剂影响胶体金胶体金制备HAuCl4

Reducer(e–)

Au0

制备原理：依据还原剂类型及还原作用的强弱，制备出胶体金颗粒大小不同胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，制备方法：

柠檬酸三纳还原法(1)取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。胶体金粒径（nm）1％柠檬酸三钠加入量（ml）*胶体金特性呈色λmax

162.00橙色518nm24.51.50橙红522nm411.00红色525nm71.50.70紫色535nm不同粒径胶体金的制备和特性注意事项原料：

氯金酸干燥、避光保存；避免用金属接触配制：

高质量去离子水

玻璃容器表面洁净无污染、可适度硅化处理鉴定与保存光吸收波长粗估或电镜观察测定胶体金平均直径洁净、避光、无尘和室温环境放置3个月，4度半年免疫金制备免疫金(Immunogold)：胶体金颗粒与抗原或抗体等大分子物质的结合物。胶体金表面的负电荷与蛋白表面带正电荷基团静电吸附形成牢固结合。标记要点胶体金溶液PH：

接近待标蛋白等电点待标蛋白质最适量

对待标蛋白做梯度稀释，寻找最适标记量标记

搅拌下，蛋白液逐滴加入胶体金，再加一定量稳定剂金标记物纯化

超速离心法

凝胶过滤法(只适用以BSA为稳定剂的胶体金标记蛋白)胶体金免疫测定技术斑点免疫金渗虑试验(DotImmunogoldFiltrationAssay,DIGFA)：原理以硝酸纤维素膜为载体并包被抗原或抗体的渗滤装置，依次滴加待测标本，免疫金和洗涤液，抗原抗体反应在膜上发生，液体被吸水材料吸收，故在膜上呈现胶体金的红色为阳性。技术要点1）将反应板平放于实验台面上，于小孔内滴加含待测抗原标本1～2滴，待完全渗入，与膜上的抗体反应而结合在膜上。

2）于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂1～2滴，待完全渗入，使胶体金标记抗体与结合在膜上抗原反应。

3）于小孔内滴加洗涤液2～3滴，待完全渗入，洗去未结合的胶体金标记抗体。4）结果观察在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点显示者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。

双抗夹心法斑点免疫金层析试验(DotImmunogoldChromatographicAssay,DICA)：原理以硝酸纤维素膜为载体，但利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析。1.打开包装取出试纸条2.直接插入待测样品中3.目测读出结果（3-10分钟内）试纸条组成结构测试线（T线）控制线（C线）胶体金垫吸水滤纸样品垫NC膜（硝酸纤维素膜）层析方向PVC底板(G)ABText1双抗体夹心（以HCG检测