紫外可见分光光度计原理及操作

关于紫外可见分光光度计原理及操作第1页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三一、紫外-可见分光光度计仪器原理第2页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三g-X-射线紫外可见红外微波无线电2004008003200(nm)波长真空紫外近红外核磁共振波长越短，能量越高原理第3页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三1）分子吸收光谱的形成过程：运动的分子外层电子----吸收外来外来辐射----产生电子能级跃迁---分子吸收谱。2）由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收

光能量的情况也就不会相同。因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。3）紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律(Lambert－Beer)。

朗伯-比耳定律是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。原理第4页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三入射光I0透射光I光程长b一、透射率T%

透射率

T%=II0×100%朗伯-比耳定律第5页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

当入射光波长一定时，待测溶液的吸光度A与其浓度和液层厚度成正比，即k为比例系数，与溶液性质、温度和入射波长有关。

当浓度以g/L表示时，称k为吸光系数，以a表示，即

当浓度以mol/L表示时，称k为摩尔吸光系数，以表示，即比a更常用。越大，表示方法的灵敏度越高。与波长有关，因此，常以表示。朗伯-比耳定律第6页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三二、紫外-可见分光光度计结构及类型第7页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三UV示意图第8页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

紫外-可见分光光度计仪器由光源、单色器、吸收池、检测器和数据系统五部分组成。一、光源

对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。1.钨及碘钨灯：340~1500nm，多用在可见光区；2.氢灯和氘灯：160~375nm，多用在紫外区。二、单色器(Monochromator)

在UV-Vis光度计中，单色器通常置于吸收池的前面（可防止强光照射引起吸收池中一些物质的分解）仪器结构第9页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三三、吸收池(Cell，Container)：

用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。四、检测器：

硅光电池、PMT、PDA五、数据系统

它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来。现在一般的紫外可见分光光度计有计算机控制和主机单片机控制两种类型，功能基本类似。仪器结构第10页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

紫外-可见分光光度计的类型很多，但可归纳为三种类型，即单光束分光光度计、双光束分光光度计和比例双光束分光光度计。1.单光束分光光度计

经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于常规分析。类型第11页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

2.双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。

双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，还能自动消除光源强度变化所引起的误差。类型第12页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

3.比例双光束分光光度计由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。这种仪器的优点是可以监测光源变化带来的误差，但是并不能消除参比造成的影响类型第13页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三6挡狭缝可选PC控制存储、调用方便可采用复制、拷贝方法在电子表格和字处理软件中处理数据和打印报告可加载膜厚、动力学、多波长、色彩分析等软件DDM（双闪耀波长双单色器）降低杂散光，提高长波长区的能量响应（UV-2550）UV-2550的特点第14页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三

三、UV-Vis分光光度法的应用及分析条件选择第15页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三一、定性分析

不同物质结构不同或者说其分子能级的能量(各种能级能量总和)或能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。

定性分析具体做法是让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度(吸光度A)，以吸光度A为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线，据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。应用第16页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三二、定量分析1.单组份定量方法1）标准曲线法2）标准对比法该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx

该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。2.多组分定量方法由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。应用第17页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三一、仪器测量条件由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。当分析高浓度的样品时，误差更大。由L-B定律：微分后得：将上两式相比，并将dT和dc分别换为T和c，得当相对误差c/c最小时，求得T=0.368或A=0.434。即当A=0.434时，吸光度读数误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程b来控制A的读数在0.15~1.00范围内。分析条件选择第18页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三二、反应条件选择1.显色剂的选择原则：使配合物吸收系数最大、选择性好、组成恒定、配合物稳定、显色剂吸收波长与配合物吸收波长相差大等。2.显色剂用量：配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制。3.溶液酸度：配位数和水解等与pH有关。4.显色时间、温度、放置时间等。分析条件选择第19页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三三、参比液选择

1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；2.试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；

3.试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。分析条件选择第20页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三四、干扰消除1.控制酸度：配合物稳定性与pH有关，可以通过控制酸度提高反应选择性，副反应减少，而主反应进行完全。如在0.5MH2SO4介质中，双硫腙与Hg2+生成稳定有色配合物，而与Pb2+、Cu2+、Ni3+、Cd2+等离子生成的有色物不稳定。2.选择掩蔽剂3.合适测量波长4.干扰物分离5.导数光谱及双波长技术分析条件选择第21页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三四、紫外-可见分光光度计的保养与故障处理第22页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三一、环境要求１、使用工作温度：15-35℃，湿度：45-80%，如果温度高于30℃，则湿度必须小于70%２、避免日光直射３、避免震动４、避免强磁场，电场５、远离腐蚀性气体，并避免置于任何可能导致紫外区吸收的含有机/无机试剂气体的区域６、避免脏污、多尘环境保养第23页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三二、工作台要求

１、可承受压力35Kg+25Kg（PC）２、最小尺寸：长：1120mm，宽：710mm，高：520mm三、电源要求

１、供电电压：100/120/220/230/240V交流±5%50/60Hz２、功率消耗：约190VA３、保险丝使用：100-120V供电，5A；220-240V供电，3.15A４、安装地点具备可靠的仪器接地端子保养第24页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三四、清洁仪器外部和样品室1、使用软布稍微蘸取水，或水溶液或者中性清洁剂溶液轻柔搽拭外表面。避免蘸取过量而导致流入仪器内部。2、清除样品室内残留液体样品，防止蒸发，避免腐蚀样品室。五、波长准确度检查（每半年一次）

利用氘灯的两个特征波长峰486.0nm和656.1nm来检查波长的精确度。保养第25页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三六、分光光度计的校正当光度计使用一段时间后其波长和吸光度将出现漂移，因此需要对其进行校正。波长标度校正：

使用镨-钕玻璃（可见光区）和钬玻璃（紫外光区）进行校正。因为二者均有其各自的特征吸收峰。吸光度标度校正：

采用K2CrO4标准液校正（在15oC时，于不同波长处测定0.04000g/L的KOH溶液（0.05mol/L）的吸光度A，调整光度计使其A达到指定的吸光度。保养第26页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三1、光度计初始化失败1）光度度没电源（检查风扇是否转动），软件没有出现初始化屏幕。（光度计状态窗口报告OFF。）2）光度计电源接通，但软件初始化屏幕没有出现，不能和光度计连接。（光度计状态窗口处于OFF。）故障修理检查项目处理方法电源线插入插座保险丝更换新的检查项目处理方法RS-232系列电缆UV-2401/2501PC确认已固定好光度计和电脑上的连接器端口.选择“Acquire(导入）”菜单下的“Utilities(工具）”，通过选择“ON”键建立与光度计的通信。初始化屏幕出现。第27页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三故障修理第28页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三步骤检查项目说明1LSI初始化参数初始化2ROM检查检查光度计的ROM3RAM检查

检查随机储存器4滤光片电机初始化检查杂散光切割滤光片位置5狭缝电机初始化检查狭缝电机位置6光源电机初始化检查光源电机位置7扫描电机2初始化检查波长扫描电机2位置(主单色器)8扫描电机1初始化检查波长扫描电机1位置(前单色器)9碘钨灯位置搜索卤素灯最大能量定位10波长原点1搜索检查波长源位置11碘钨灯能量搜索检查卤素灯能量12氚灯最大位置搜索

氚灯最大能量定位13氚灯能量搜索检查氚灯能量14波长原点2搜索检查0NM波长位置15待命初始化完毕第29页，讲稿共33页，2023年5月2日，星期三3）在初始化阶段出现的错误（红色标记出现）初始化错误和相应的处理方法初始化步骤检查项目处理方法1-7（UV-2401/2450）1-8（UV-2501/2550）这些项目的初始化失败需要通过岛津制作所或其指定代理商来处理。8-13（UV-2401/2450）1-14（UV-2501/2550）光源：打开光源室罩看光源是否成套。（不要直视氘灯过长时间，长时间暴露在UV辐射下会对眼睛有伤害）关闭光度计和电脑，再次开始启动过程。观察灯是否亮，如果不，则此灯应更换。碘钨灯可使用2000小时，氘灯可使用500小时间。更换后重新启动。样品室检查是否有杂物阻挡光束。去掉杂物重新初始化。样品室确认样品室门已关