解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）作业指导书

解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）作业指导书1目的建立解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）作业指导书，确保生产过程处于受控状态。2范围适用于解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）相关工序的操作者。3职责3.1操作人员应严格执行本作业指导书。3.2生产主管负责监督检查。3.3质检部质检员负责抽查执行情况。4工作内容4.1生产工艺流程图※胶体金制备胶体金制备★胶体金反应膜检测胶体金标记胶体金反应膜检测胶体金标记抗体检测抗体检测单克隆抗体制备单克隆抗体制备★贴板产品检测装卡分包质量检测切贴板产品检测装卡分包质量检测切条NC反应膜检测NC膜包被★NC反应膜检测NC膜包被抗原检测解脲重组抗原的表达NC膜处理NC膜检测※NC膜处理NC膜检测入库入库抗体检测兔抗鼠IgG抗体制备抗体检测兔抗鼠IgG抗体制备注：※关键过程★特殊过程4.2作业内容4.2.1胶体金制备（柠檬酸三钠还原法）氯金酸（HAuCl4）水溶液放入三角瓶内加热至沸腾→加热柠檬酸三钠溶液→混匀，搅拌煮沸10至15分钟→待胶体金溶液颜色由蓝→紫→红，冷却即可。4.2.2金标抗体（反应膜）制备以0.1M碳酸钾溶液调胶体金溶液pH8.0-9.0→加入解脲支原体单抗，15分钟后加入聚乙二醇→离心，调532nm测OD值5～10，方阵滴定法选定标记工作浓度→用无纺布浸湿胶体金溶液，干燥、平整，检测。4.2.3金标抗体反应膜质检将制备好的金标抗体反应膜按5‰比例抽检，与标准反映膜匹配组装成品，同时与标准成品作如下对照检测。a)符合率：样品稀释液、阴性质控品无假阳，高、中、低浓度（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）支原体阳性质控品均呈阳性。b）敏感度：最小检出0.1μg/ml支原体阳性质控品。c)反应强度：+/+++（阳性反应线/阴性反应线）。d)反应时间：30s～5min。确认合格后才能转入下一工序。4.2.4NC反应膜制备亲和性高分子硝酸纤维素膜→活化处理12小时→用水洗5次，每次20分钟→室温干燥后→取纯解脲支原体MB蛋白单抗和兔抗鼠IgG抗体溶于10%CS中，浓度均为2mg/ml，用解脲支原体单抗在NC膜上包被衣原体阳性反应线→用兔抗鼠IgG抗体在NC膜上包被阴性对照线→干燥后，用BS液封闭H2O清洗后，室温干燥，备用。4.2.5NC反应膜质检4.2.5.1常规图形模式检测：将制备好的反应膜按5‰比例抽检，与标准金标抗体反应膜匹配组装成品，同时与标准成品对照检测；观察阳性、阴性包被线及本底，要求图形规则程度均匀，无遗漏或重复包被。4.2.5.2均一性，灵敏性和符合率筛选：按3%比例/批，随机取样，每张5～10人份，作阴性参比品和高、中、底（0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml）三个浓度的阳性参比品检测，灵敏度解脲支原体最小检出0.1μg/ml，无假阳性，均一性≥99%。4.2.6反应体系组装组装材料材料规格（mm）组装方式反应膜（S1）20见图1无纺布（S2）25，30吸水纸（S3）30金标反应膜（S4）10双面胶带（S5）29，48塑料垫板S678单面胶带S7154.2.6.1反应体组装程序：a)在S6塑料基板上贴双面胶带S5（29，48mm）二条；b)在S5上贴反应膜S1（20mm），S1上下缘距S6上下缘各29mm；c)在S6上贴吸水纸S3（30mm），吸水纸下缘与S1上缘交接1mm,上缘与S5的上边缘对齐；d)在S5下端贴无纺布S2-1，其上缘压住S1下缘1mm；e)在S2-1上平放金标抗体反应膜S4（10mm）上缘对齐；f)在S4上平放无纺布S2-2（30mm）上下缘分别S4、S6对齐；g)将组装成型的反应体系用电脑可调式切割机切成5mm测试条，装入干燥器，待包装。4.2.6.2成品包装：每支成品先装聚苯乙烯塑料外壳，再用镀铝膜包装加干燥剂，附说明书，打批号入库，每批留样100人份，以备复检．4.2.7质控品制备4.2.7.1解脲支原体MB蛋白阳性质控品取基因工程表达解脲支原体MB蛋白抗原，以样品稀释液（A液和B液1：1混合液）分别配成高、中、低（10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml）三个浓度，0.5ml/支分装，-70℃保存。4.2.7.2解脲支原体MB蛋白阴性质控品含0.1mg/ml牛血清白蛋白样品稀释液（A液和B液1：1混合液）,0.5ml/支分装，-70℃保存。4.3成品检测《解脲支原体MB蛋白金标检测试剂盒（胶体金法）》产品注册标要求。4.3.1外观4.3.1.1要求a）检测条：表面应平整、无划伤、开裂、变形及污渍；检测卡各组分附着牢固、内容齐全；b)检测卡：外壳应平整，上下盖应均匀合拢，无明显间隙；反应芯试条在外壳内应附着牢固；4.3.1.2检验在自然光线下，用手感和目力观察方法进行检验。4.3.2灵敏度4.3.2.1要求检测卡可以测定出0.1μg/ml的解脲支原体MB蛋白，凡解脲支原体MB蛋白等于和高于该浓度时检测线和对照线均显色，而低于该浓度时检测线不显色，但无论任何浓度对照线均应显色。4.3.2.2测试a)试剂1)空白对照液：样品稀释液；2)测定样品液：10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml，＜0.1μg/ml四个浓度的质控品。b)测定方法随机从同批待测试剂盒中抽取足量试样对空白对照液和每个浓度的样品液分别进行测定，每个浓度测定重复测定10个检测卡。测定时取约4滴处理好的样品液在测试板右端的圆加样孔中，平放，等待3～5分钟观察测试板中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。c)结果以下结果为合格：测定空白对照液的试剂盒检测线不显色，只有对照线显色。测定浓度≥0.1μg/ml解脲支原体MB蛋白样品液的试剂盒检测线和对照线均有显色，且在测定阈值以上的检测线色带随解脲支原体MB蛋白的浓度升高而色带加深。4.3.3符合率4.3.3.1阴性符合率4.3.3.1.1要求试剂盒测试解脲支原体MB蛋白阴性质控品10份，假阳性判断结果不多于1份，符合率应≥90%。4.3.3.1.2测试随机从同批待测试剂盒中抽取10个检测卡，测定阳性质控品10份。测定时取100μl阳性质控品加在检测卡加样孔中，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。4.3.3.2阳性符合率4.3.3.2.1要求试剂盒测试解脲支原体MB蛋白含量高于0.1μg/ml的阳性质控品10份，假阳性判断结果不多于1份，符合率应≥90%。4.3.3.2.2测试随机从同批待测试剂盒中抽取10个检测卡，测定阴性质控品10份。测定时取100μL阴性质控品加在检测卡加样孔中，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。4.3.4重复性4.3.4.1阴性重复率4.3.4.1.1要求使用试剂盒检测同一份阴性质控品10次，同一份质控品的阴性判定结果应基本一致，假阳性判定结果不多于1份，阴性重复率应≥90%。4.3.4.1.2测定随机从同批待测试剂盒中抽取10个检测卡，测定时取100μl阴性质控品加在检测卡加样孔中，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。4.3.4.2阳性重复率4.3.4.2.1要求使用试剂盒检测同一份阳性质控品10次，同一份质控品的阳性判定结果应基本一致，假阴性判定结果不多于1份，阳性重复率应≥90%。4.3.3.2.2测定随机从同批待测试剂盒中抽取10个检测卡，测定时取100μl阳性质控品加在检测卡加样孔中，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。4.3.5精密性4.3.5.1要求每批试剂盒随机抽取10个检测卡样品，用同一份阳性UU质控品进行检测，要求各检测卡的显色应均一。4.3.5.2测定随机从同批待测试剂盒中抽取10个检测卡进行检测。测定时取100μl阳性UU质控品加在检测卡加样孔中，平放，等待3～5分钟观察检测卡中部检视窗的结果，但不可超过20分钟读结果。4.3.6稳定性4.3.6.1要求a）在37Cb）在