临床免疫学检验-课件-第3章-抗体制备

第三章抗体制备第一节免疫原的制备第二节免疫佐剂第三节多克隆抗体的制备及应用第四节单克隆抗体的制备及应用第五节基因工程抗体及应用第一节免疫原的制备免疫原：用来制备相应抗体的抗原,

是制备高质量Ab的重要保证。条件：表位的分子结构、空间构象刺激作用好；分子量尽可能大；尽可能纯（免疫纯）。

一、颗粒性免疫原（细胞抗原、细菌抗原）的制备二、可溶性抗原制备三、半抗原摇动15-20min

4℃可保存3周取适量

NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至

2～5%一、颗粒性免疫原的制备

绵羊红细胞的制备流程图组织细胞悬液的制备流程图肾、肺→剪碎、洗涤、离心→胰酶消化→单个细胞

细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养

37℃24h100℃水浴

2～2.5h

杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原免疫方法：颗粒性抗原呈乳浊状，多用静脉内免疫，较少用佐剂作皮内注射。来源:

组织和细胞，其成分比较复杂。

二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二、可溶性抗原

(一)组织和细胞可溶性抗原的粗提1、组织细胞抗原的制备取组织剪碎粉碎（高速组织捣碎机法、研磨法）上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN3冷浴中组织剪碎装入捣碎机筒内高速粉碎或乳钵研磨制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心

(一)组织和细胞可溶性抗原的粗提2、细胞可溶性抗原的制备1)酶处理法2)反复冻融法3)超声破碎法4)表面活性剂处理

常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等

1.酶处理法1)酶处理法方法：在一定的条件下，能消化细菌和组织细胞。

特点：①此法适用多种微生物；②作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。2)反复冻融法方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。

3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。3)超声破碎法特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。

4.表面活性剂处理原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。4)表面活性剂处理常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取核酸时，常用此法破碎细胞。(二)可溶性抗原的纯化1、超速离心法2、选择性沉淀法

盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法、核酸沉淀剂法3、凝胶层析法4、离子交换层析法5、亲和层析法差速离心（DifferentialCentrifugation）:用于分离大小和密度差异较大的颗粒。密度梯度离心（DensitygradientCentrifugation）:常用于分离沉降系数不同的组分，不适于大量制备实验。

等密度梯度离心（IsopycnicgradientCentrifugation）常用于分离密度不同的组分。1、超速离心法离心方法的选择方法离心特点分离效果适用范围差速离心短时间、多次用不同速度和时间离心。粗分离，纯度和效率不高。分子量相差大、不稳定、易变性的物质。常用于分离细胞器和病毒。密度梯度离心短时间，低速度，样品不完全沉降。效果较好，可分出较纯颗粒。大小不同而密度相似的物质。可分离核酸、蛋白质、核糖体亚基和脂蛋白等。等密度离心长时间，高速度，样品完全沉降到平衡位置。效果较好，可分出较纯颗粒。大小相同而密度不同的物质。可分离复合蛋白质、核酸、亚细胞器等。盐析法：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。有机溶剂沉淀法；蛋白质和核酸的提纯。蛋白质通常采用乙醇或丙酮进行沉淀，

DNA和RNA可用乙醇或2-乙氧基乙醇进行沉淀。非离子聚合物沉淀法：应用于蛋白质、核酸、酶、细菌和病毒的分离纯化。2、选择性沉淀法原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，

经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。3、凝胶层析法图3-5凝胶层析原理示意图A小分子进入凝胶颗粒内部被滞留，大分子被排阻在凝胶颗粒外面；B（1）样品溶液上柱；（2）样品溶液流经层析柱；（3）小分子被滞留，大分子向下移动；（4）大小分子完全分开；（5）大分子流出层析柱，小分子尚在柱中。

原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4、离子交换层析法图3-4离子交换层析原理示意图1.平衡阶段：离子交换剂与平衡离子结合；2.交换阶段：样品与平衡离子交换；3.阶段洗脱：缓冲液洗脱，结合力弱的分子洗脱下来；4.终末洗脱：结合力强的分子洗脱下来；5.再生阶段：酸或碱处理，再用洗脱液平衡，即可恢复初始状态。

原理：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。酶与底物、受体与配体、抗体与抗原5、亲和层析法正常细胞＋标记细胞洗涤标记细胞被酶裂解加入特异性抗体其它蛋白洗涤流失SDS分离蛋白

亲和层析法示意图分离纯化方法的比较方法原理优点缺点应用离心分离法离心力和物质沉降系数的差别操作简单分辨率低蛋白质分离盐析法盐析作用操作简单，成本低，重复性较好分辨率低，纯化倍数低蛋白质的分级沉淀有机溶剂沉淀法脱水作用和降低介电常数操作简单，分辨力较强对蛋白质有变性作用，成本较高蛋白质、多肽、核酸和多糖的分级沉淀凝胶层析法分子筛的排阻作用分辨力强，不引起蛋白质变性成本高分子质量有差别的可溶性物质离子交换法离子基团的交换作用分辨力强，分离量大费时间，酸碱用量大可电离的生化物质亲和层析法分离物与配体间的亲和作用分辨力很强一种配体只分离一类物质，局限性大生命大分子物质

二、可溶性抗原制备及鉴定温和条件解离可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋白亚单位分开。二硫键解离氧化法和还原法是将免疫球蛋白轻、重链分开的两种常用方法。溴化氰裂解法酶裂解法酶对免疫球蛋白的水解有极好的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解为不同的片段。(三)免疫球蛋白片段的制备

酶水解免疫球蛋白示意图Fc段，用以制备抗重链血清F(ab’)2，常作为抗体试剂用于试验木瓜蛋白酶（papain)胰蛋白酶(pepsin)胃蛋白酶(pepsin)1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。2.载体：蛋白质类多肽聚合物大分子聚合物3.半抗原-载体连接方法:三、半抗原

载体类型

1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。载体类型2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦可诱发动物产生抗体。

半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：戊二醛法:氯甲酸异丁脂法：琥珀酸酐法：半抗原载体连接方法

二、可溶性抗原制备及鉴定四、纯化抗原的浓缩和保存纯化抗原的浓缩吸附浓缩:通过吸附剂吸收溶液中的溶剂分子以达到浓缩目的的方法。常用的吸附剂有聚乙二醇（PEG）、凝胶、蔗糖等。

蒸发浓缩超浓缩:采用具特定孔径的滤膜，通过滤膜对溶液中不同溶质分子进行选择性过滤的方法。尤其适合用于蛋白质和酶的浓缩及脱盐，具有成本低、操作方便、能较好保持大分子物质生物学活性及回收率高的优点。

纯化抗原的保存：置低温保存。

1.含量鉴定

2.理化性质鉴定①凝胶层析技术测定

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

③凝胶管状电泳

④超速离心3.纯度鉴定

常用醋酸纤维膜电泳

4.免疫活性鉴定

常用双向琼脂扩散试验五、纯化抗原的鉴定第二节免疫佐剂（adjuvant）

1、概念

预先或与抗原同时注入机体，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。

2、种类

⑴生物性：BCG、CP、LPS⑵人工合成：polyI:C、polyA:U⑶弗氏佐剂与弗氏不完全佐剂：动物实验最常用⑷无机物：氢氧化铝、明矾颗粒性抗原:

一般不使用佐剂可溶性抗原:

初次免疫使用佐剂完全弗氏佐剂:

不宜连续使用两次佐剂的使用原则

3、应用：

⑴预防接种；

⑵抗肿瘤和慢性感染。第三节多克隆抗体的制备及应用克隆（clone）：由单一细胞增殖形成的细胞群体，称为细胞克隆。多克隆抗体（polyclonalantibody）:由于天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原决定簇，刺激机体免疫系统，可使体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对多种抗原决定族的免疫球蛋白，获得的抗血清是含多种抗体的混合物，因而称多克隆抗体，也称为第一代抗体。

抗血清的条件：尽量选用特异性强、效价高、亲和力高。抗血清的分类按用途：诊断血清、治疗血清、预防血清。按成分：单价血清、多价血清。

能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。

兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。

1.抗原与免疫动物的种系关系:亲缘关系越远越好；

2.动物的机体状态：选适龄、健壮、无感染的正常动物、雄性,体重合乎要求；

3.按需要量选择大小不同的动物:量大用羊、马；量小用豚鼠、家兔；一、免疫动物的选择

4.按抗血清性质的要求选择动物：R型抗血清：兔；H型抗血清：马(极少用于沉淀反应)。

5.抗原的要求：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；蛋白质免疫--大多数动物皆适合，常用羊、兔;胰岛素免疫--选用豚鼠等进行；甾体激素类免疫--多用家兔；酶类免疫--多用豚鼠。

二、免疫方法

3.一般而言，小鼠首次免疫剂量为50-400μg/次，大鼠0.1-1mg/次，兔0.2-1mg/次，加强免疫剂量为首剂量的1/5-2/5。

1.剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激，剂量过高，可导致免疫耐受，合适的剂量则可诱导抗体的产生。

2.在一定的剂量范围内，抗原量越大，免疫效果越好。抗原用量一般按体重计算:小动物：0.1-0.6mg/只；大动物：0.5-1.0mg/只；半抗原应用同一载体。

4.如需制备高特异性抗血清，可选择低剂量短程免疫法，而要获得高效价抗血清，宜采用大剂量长程免疫法。

二、免疫剂量的选择

1.免疫间隔:首次与二次免疫一般间隔10-20d为宜;三次免疫以后间隔7-10d为宜.免疫的总次数多为5-8次.

2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为:静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌

3.不同抗原可采用不用的免疫途径：颗粒性抗原：多用静脉注射可溶性抗原：多用皮内;皮下;淋巴结;足掌多点注射半抗原：多用皮内多点注射三、免疫时间和途径的选择

三、动物采血法四、采血方法

1.采血时间：动物免疫３-５次后，抗体效价经检测合格后，可采血。一般在末次免疫5-7天，采血前动物应禁食24h。2.采血原则：无气泡、不溶血、无菌操作.

三、动物采血法3.采血方式：颈动脉放血法：最常用心脏采血法：家兔一次可采20-30ml,要求操作熟练静脉多次采血法：采集血液量最多.4.抗血清的分离

自然条件下凝固置37℃或4℃使血块收缩：37℃时：快、血清较少；4℃时：时间较长，可能溶血，但析出的

血清多，效价稳定。分离血清2000r/min,离心10min.56℃30min，灭活补体。

1.抗体效价(含量)的鉴定：凝集、双扩、放免

2.抗体特异性鉴定：

①细菌类抗原的抗体用凝集试验②可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验

3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法(SDS)

4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好(放免)五、抗血清的鉴定和保存1.4℃保存：加NaN3(叠氮钠),

可保存3～6个月2.低温保存：分装,

-20～-40℃，可保存5年3.冷冻干燥保存：可保存5～10年抗血清的保存六、抗体的纯化IgG类抗体的纯化1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取γ球蛋白

3次，基本为IgG类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个

IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等

一、抗体特异性的纯化

1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。特异性抗体的纯化多克隆抗体的实际意义：预防、治疗感染性疾病(人工被动免疫)

如：破伤风抗毒素血清抗破伤风

副作用：超敏反应临床诊断(免疫学检测):

如：肥达氏反应

伤寒、副伤寒，抗血清的优点:来源广泛（来源于动物或人）,制备容易。抗血清的缺点:特异性不高,容易发生交叉反应产量有限，重现性差免疫原性弱的抗原，很难产生抗体质量控制难

第四节单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)

：由一个B细胞杂交瘤细胞克隆产生的只识别抗原分子上一种抗原决定簇的抗体分子。也称为第二代抗体。特点：具有高度均一性(同种型、抗原结合部位、独特型都相同)生物活性专一,特异性强，纯度高。体外可大量制备，亲和力强。

一、杂交瘤技术的基本原理

1.杂交瘤细胞:2个细胞杂交,有1个细胞是瘤细胞，则融合的细胞称为杂交瘤细胞。亲本细胞:小鼠-小鼠;大鼠-大鼠;小鼠-人;人-人。该细胞具有两种亲本细胞的基因和特性,是一种特殊的杂种细胞系。2.B杂交瘤细胞：体外增殖,分泌McAb。

骨髓瘤细胞

--无限增殖；

免疫B细胞

--合成、分泌特异性抗体。3.杂交瘤技术制备McAb所依据的三个原则淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一种克隆只产生一种抗体。细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可保持双方亲代细胞的特性。利用代谢缺陷补救机理，可筛选出杂交瘤细胞。

二、杂交瘤细胞的制备过程亲本细胞的选择与融合杂交瘤细胞的形成杂交瘤细胞的筛选HAT选择培养基1、亲本细胞的选择与融合（1）融合细胞的选择被高纯度免疫原刺激的Balb/c株小鼠脾细胞：能产生抗体，体外不能培养。同一品系小鼠的骨髓瘤细胞：不能产生抗体，体外可人工培养。次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型筛选方法：

反复腹腔注射降植烷等(油类制剂)─────→Balb/c株小鼠→适宜培养条件小鼠骨髓瘤细胞─────→无限繁殖，分泌某种Ig筛选原则：1.骨髓瘤细胞最好本身不产生Ig(如：小鼠骨髓瘤P3、653和Sp2/0细胞株)。2.选育出缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)的细胞株－HGPRT缺陷株。附：小鼠骨髓瘤细胞的筛选HGRPT缺陷株的选育方法：

1.通常采用毒性药物８-AG(氮鸟嘌呤)，选育出HGRPT缺陷株。2.利用５－BudR(溴脱氧尿嘧啶)诱发缺乏胸腺嘧啶核苷激酶(TＫ)的突变细胞株，以选HGRPT－细胞株。注：在多次传代培养过程中，有个别小鼠骨髓瘤细胞可能出现返祖现象，故应定期用８-AG

处理细胞。（2）用细胞融合剂使两类细胞融合(杂交)

最常用的为聚乙二醇PEG。分子量<1000液态；>1000固态；对细胞有毒性，毒性随分子量的增加而加重。实验一般选1000、1500、2000，应用浓度为40%（W/V）。融合细胞的机理不明。

细胞融合骨髓瘤细胞

PEG脾细胞融合后细胞的类型:

未融合的脾细胞

杂交瘤细胞

未融合的瘤细胞杂交瘤细胞2、选择培养杂交瘤细胞(HAT选择培养基)(1)HAT培养基的成分：常用细胞培养基。次黄嘌呤(H，核苷酸的前体),氨基蝶呤(A，叶酸拮抗物，阻断DNA合成)胸腺嘧啶核苷(T)。合成DNA两条途径：主途径：糖+AA(需辅酶叶酸参与)→核苷→DNA次途径：

H+T－－→DNAHGPRTTK（2)融合后细胞在HAT培养基中存活情况脾细胞(HGPRT+,TK+)不能长期生长，5-7天死亡骨髓瘤细胞(HGPRT-,TK-)合成DNA被氨基蝶呤(A)阻断，又缺乏HGPRT，不能利用次黄嘌呤(H)合成DNA而死亡不能生长杂交瘤细胞(HGPRT+,TK+)能够生长细胞的多聚体：容易死去。抗原(多表位)免疫小鼠骨髓瘤细胞培养

免疫脾细胞骨髓瘤细胞

PEG

细胞融合

HAT培养基杂交瘤细胞的筛选与克隆化

McAb的大量制备单克隆抗体的制备程序B杂交瘤细胞的制备亲本细胞的选择与融合杂交瘤细胞的筛选(HAT选择培养基)阳性克隆的筛选和克隆化单克隆抗体的制备单克隆抗体的纯化抗原特异性杂交瘤细胞的筛选筛选：目的：筛选出能分泌特异性Ab的杂交瘤细胞(阳性细胞)。方法：免疫荧光、ELISA等检测培养液中的特异性Ab。克隆化：采用有限稀释法充分稀释→0～几个细胞→培养(30%的孔为0才能保证每个孔中为单一细胞)→上清，ELISA检测特异性Ab。再克隆化：上述阳性细胞株再克隆化，ELISA重复检测，大量增殖，保存，体外培养或腹腔注射。有限稀释法操作示意图

三、单克隆抗体的生产大量制备单克隆抗体的方法：体内诱生法：杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔中,取腹腔液，离心取上清液。体外培养法:用于实验室制备少量McAb；杂交瘤细胞→细胞培养→上清液中分离McAb。四、单克隆抗体的纯化对于日常诊断或定性研究，无需提纯。如用于交联荧光素、酶、同位素或生物素等，必须进一步分离和提纯。

纯化的方法：过滤、离心去除大颗粒物，再用盐析、凝胶过滤、离子交换层析等纯化，常用亲和层析法。五、单克隆抗体的鉴定单克隆抗体的鉴定定性：抗原特异性、Ｉg类型、决定簇、亲和性等。定量：效价。杂交瘤细胞的冻存和复苏冻存：采用液氮(-196℃)保存，常以小牛血清或RPMI-1640培养液配成最终浓度10％的二甲亚砜(DMSO)为冻存液，“慢冻”。复苏：冷冻管立即浸入37～40℃水浴中“快融”，将细胞移入培养液中洗涤（去DMSO），离心。四、单克隆抗体在医学上的应用（1）临床检验诊断试剂；（