第五章-分子生物学法上

第五章分子生物学基本研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的重大事件（三大成就）：一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者（即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题）；二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。5.1基因操作的基本工具5.2DNA操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆（clone）技术5.6蛋白质与蛋白质组学技术（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端（不是整齐地切开，即在两条链上的切开位点不对称）的小片段。5.1基因操作的基本工具图5-1几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点（二）基因克隆的载体基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子。在此基础上,将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节:

目的基因和载体的获得;

目的基因与载体连接,形成重组分子;

重组DNA分子导入宿主细胞;

含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增；

基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。基因教克隆目载体尚的三旧要素脱：自我童复制袭能力烫；携带颈外源岛基因梨片段均大小浴；插入美位点妥多少尤；易于门鉴定雄识别胁程度宁。大肠押杆菌扁质粒斑载体完:1、浑pS竹C1贫01洽质粒馋载体低拷窄贝数倾严紧弃型复钩制控僚制的巧大肠值杆菌浊质粒池载体乌，平仓均每侧个寄您主细泼胞仅仇有1~才2个拷锈贝。长9.涌09取kb，带剃有四窃环素仁抗性痛基因锈（te闹tr）及Ec伙oR描I、Hi箩nd碗II快I、Ba茶mH仆I、Sa骑lI、Xh津oI、Pv竖uI跟I以及Sm做aI等7种限竖制性赵核酸俗内切笔酶的纤单酶吴切位押点，是在Hi励nd境II请I、Ba辞mH将I和Sa欧lI等3个位君点插老入外乐源基剥因，亡会导米致te剧tr失活肠。大肠陶杆菌铅pS崭C1毫01湾质粒券载体闯示意为图。是第纤一个慕真核顿基因事克隆董载体钢。缺点号：它是钱一种腊严紧隙型复萄制控鼠制（在侍寄主烈细胞刮内的全复制导除了衬受本夏身的栽复制懂机构缺的控铲制外旋，还圾受染处色体域的严矿紧控问制，皱因此丝式拷贝叶数较伙少，桑一般仅只有目1—副2个邮/每走染色泉体。柳）的低筝拷贝叛质粒肃，从蛮带有般该质烧粒的岸寄主圈细胞悼中提嘴取p亩SC末10群1喊DN嘱A，慎产量蹦很低庸。2、俭Co将lE廉1质原粒载肺体松弛皂型复效制控成制的绩多拷庸贝质券粒。一般保情况作下，织当培老养基跟中氨炼基酸算被耗放尽，析或是谢在细震胞培沈养物避中加贤入氯椅霉素罗以抑密制蛋任白质农的合豆成，岸寄主岭染色穷体DN盛A的复差制便娇被抑质制，肚细胞超的生态长也毯随之室停止龄。而松枝弛型姑质粒DN俩A却继那续复演制数激小时粪，使萝每个刻寄主课细胞蛇中Co贸lE题1质粒桑的拷俱贝数辉达到10霜00勒~3态00顺0个，他占细掩胞总DN棉A的50军%左右目。3、跑穿梭洽质粒摘载体柜（s誉hu康tt好le豆p次la杰sm预id听v大ec态to性r）指由暗人工启构建徐的具搭有两背种不炒同复摄制起侧点和抵选择财记号坐，可奸在两崖种不幸同的遇寄主肺细胞勾中存漆活和屿复制棵的质贷粒载辈体。顽由于剪这类浅质粒凤载体纲可以溉保证讨外源蚁DN泄A序羞列在分不同赛物种俭的细麦胞之泳间得澡到扩过增，贩能在桶原核水和真倦核细命胞之芬间往换返穿捡梭，斤具有秧广泛蚀的用筒途。5.宪2牧.活1寨核酸猴的凝雄胶电预泳自从河琼脂冤糖（乌ag纤ar为os榴e）旦和聚裕丙烯覆酰胺绘（p俊ol歉ya价cr四yl博am垫id腰e）白凝胶柴被引云入核松酸研足究以柔来，黑按分叠子量们大小识分离任DN爆A的壶凝胶坐电泳疤技术微，已相经发机展成删为一期种分哥析鉴息定重佛组D驼NA妹分子江及蛋掘白质叠与核冲酸相沉互作贩用的苦重要古实验弯手段啊。5.骆2伙D黄NA丘操作酸技术一种畏分子额被放峰置到均电场迷中，露它就总会以肆一定迷的速伸度移把向适抢当的感电极榨。我妄们把猛这种修电泳横分子姑在电悄场作详用下绳的迁袜移速矿度，续叫做怪电泳科的迁移召率，它与锦电场忆强度肉和电蛛泳分握子本院身所惑携带或的净希电荷酿数成涌正比诸，与葡片段乓大小怀成反东比。生理纺条件沾下，增核酸计分子效中的峡磷酸尾基团腊呈离终子化箭状态毫，所充以，DN链A和吸RN宝A又伯被称叮为多露聚阴秀离子（p鬼ol靠ya负ni驶on承s）营，在孝电场姨中向正膛电极幼的方匆向迁完移。由于臂糖-班磷酸禁骨架拼在结糟构上刑的重检复性撕质，约相同抱数量俯的双养链D轮NA晴几乎销具有掘等量放的净洋电荷遍，因旧此它尖们能以同似样的扮速度育向正猫电极废方向怜迁移。琼脂裤糖凝预胶分遇辨D锯NA含片段番的范献围为宽0.惨2~打50下kb同之间洲。聚丙置烯酰欺胺凝怒胶的思分辨茂范围症为1片到1荐00些0个宣碱基羊对之塌间。凝胶牧浓度怒的高渗低影林响凝压胶介尤质孔刮隙的医大小叔，浓桨度越伶高，伏孔隙鸡越小灶，其相分辨涌能力扛就越颗强。琼脂股糖及跑聚丙裳烯酰摸胺凝臭胶分旗辨D的NA舍片段易的能吐力凝胶终类型胜及浓童度厌分离币DN徐A的捆大小观范围畏（b划p）0.熄3%漫琼脂未糖舟50博0赚00准~1义0辰000.竭7%仗琼脂润糖黑20姿0蜡00致~1恒0妇001.性4%阳琼脂住糖皮6缝00仓0~颠30盛04.卸0%恰聚丙气烯酰辅胺属1生00萝0~产10怜010晃.0创%聚渗丙烯范酰胺变50宵0~肥2520生.0痰%聚按丙烯益酰胺球50澡~1溴化能乙锭议染料禁的化施学结氏构及涌其对迁DN欢A分廉子的担插入往作用烧。由于蝇插入管了溴秘化乙慈锭分禁子，沸在紫惑外光株照射芒下，脑琼脂拦糖凝鸡胶电撞泳中患DN昏A的洲条带赵便呈鱼现出寸橘黄定色荧土光，皂易于池鉴定断。（溴化浪乙锭庸是高宴度灵剪敏的睡荧光腿染色稻剂，具有狸高致惧癌性替!普通姐浅黄象色乳纵胶手益套不遥能很蒜好的喇阻挡扬，最紧好用劝蓝色赛实验剑用手近套。迹）DN尚A脉锡冲电道场凝湿胶电爹泳（合PF耽GE经pu唤ls凯ed液-f甜ie浴ld趁g艘el节e秒le蒙ct洲ro狼ph艺or之es瓶is苏）示意哭图在脉成冲电哲场中黄，D忠NA丑分子税的迁发移方旬向随避着电维场方斩向的得周期悠性变替化而粮不断预改变搁。在亿标准树的P映FG议E中穷，第迁一个期脉冲买的电揪场方搏向在竭另一菠侧成奥45劫°夹携角。未由于廊琼脂底糖凝叛胶的嫌电场住方向效、电革流大勺小及豆作用畅时间冒都在秀交替扶变化青，使宁得D掠NA哈分子型能够烧随时匪调整部其游少动方谣向，建以适摔应凝乓胶孔沃隙的蝴无规交则变蚁化。5.过2已.端2俭细树菌转社化与凑目标助DN宪A分剖子的制增殖通过警细菌脊转化悠方法聋将体寻外构覆建好趁的杂顶种D祥NA尝分子躁导入粒宿主庆细胞滔中。冰外源耐DN看A通坚过自猪身载拿体上苹的复裁制起阵始点存进行由复制饥增殖像，能给在宿寨主细巨胞中梯长期梳保存促下来胃，并例能以箱完整报的形猾式从仗细胞撇中被假分离乎纯化妨出来白。细菌祥转化（t等ra加ns羞fo嚼rm饶at紧io寇n）枪，是趁指一富种细痒菌菌鸣株由沿于捕适获了贫来自睬供体详菌株伪的D允NA往而导菠致性哨状特栋征发乒生遗凡传改昏变的姜过程蛙。提供樱转化说DN僵A的芝菌株怜叫作供体馆菌株，接轰受转技化D筋NA雨的细傻菌菌剂株则献被称贱为受体腔菌株。细菌屠转化骗及蓝效白斑朱筛选为提榜高效旨率，省可对鸭受体妇菌进么行物珍理或竹化学貌处理握，增睛加其农获取员DN灿A的嘴能力询。经年过这摘种处彩理的显细胞浮被称袋作感诱受态由细胞蚀（c犹om嘱pe堵te蚊nt喊c菠el甜ls略）。蓝白壁斑筛践选原理封图两种排增强吉转化逼的处论理方武法：①嫌Ca沃Cl2法将快错速生贫长期难大肠蛮杆菌奴置于索经0辅℃预坚处理雀的低丈渗C窑aC义l2溶液盖中，尾细胞刃膨胀支，膜励通透替性改算变，珠易与恰外源砌DN金A相压粘附姻。将该成体系占转移纽奉到4象2℃恰下做倍短暂爬的热哄刺激娇，外男源D芝NA泊就可煤能被故细胞是吸收施。将肉经过恐转化提后的论细胞雾置于敲选择糊性培南养基禾上，和筛选礼阳性梨克隆汉。转化算效率仰可达脆到5仗×1垦06~2摔×1音07个转化贱子/µ词g超即螺旋期质粒茂DN交A（转化遮后的歪受体括菌称嗽为转赢化子胖tr供an局sf浊or桐ma制nt）。②锻电击籍法电脉蜻冲（电横场强别度、达方向闸或电领流的订周期狡性变柄化）绿可以摘在细上胞膜属上造渡成小受凹陷族，形泼成疏贞水孔影洞。长随着摆跨膜廊电压炮增加鞋，大局疏水打性孔寇洞会阀转变纽奉为亲静水性蚊孔洞亡，介骡质中狐的D撕NA狗易于娱进入禁细胞谢质。电脉找冲处饰理的胃具体屑方法潮：将生塔长至质对数宝中期巩的E息.边co榆li条菌液强冷却若至4休℃后钻离心店，洗重菌后卸用1定0%石的甘锅油悬额浮，著将高调密度凝菌液抛（~元2×勒1010/m披l）餐置于均特制刮的电胸极杯覆中进岔行电惯击。获得皂最大日转化陷效率狠时场泛强一鞋般为12致.5衣~1犯5k带V/添cm，时餐间跨泪度一垂般为4.划5~遵5.兼5毫仙秒。电击凑转化管与温塌度有转关，蒸一般粱在0~辉4℃进行强。由舟于转旷化载纺体上灶常带绳有La崇cZ基爆因（大肠围杆菌半乳糖墨操纵信子中梳的一害个基取因），多窜用带调有不叫同抗委生素枕（常周用的星抗生串素包规括氨棒苄青抛霉素翠、卡带那霉译素和耳四环覆素等倚）的言选择表性培尊养基禁结合升蓝白洞斑筛房诚选法仅鉴定少转化冶细胞洒。5.糖2暗.巨3聚陡合酶篮链式曾反应愁（P海CR级）技氧术聚合丈酶链冷式反仍应是蚂快速大扩增厦DN轿A序从列最若常用队的方补法。PC刺R反哗应的杰模板她DN苹A若泻是基误因组在上的蓝某个膨片段境，就石称为型ge柏no冒mi垂c柏PC短R，星若是似mR凡NA盼反转烧录产懂生的灵cD尊NA屈，就协称为任RT为-P旺CR盗。PC席R技敲术的至原理纷：首先刻将双品链D培NA爆分子魂在临策近沸煤点的昌温度先下加私热分间离成祥两条悔单链留DN踪蝶A分泳子，纠DN防A聚狱合酶答以单结链D靠NA普为模来板并绢利用欲反应血混合完物中比的四匙种脱饮氧核轧苷三驰磷酸询合成谢新生片的D羊NA拖互补椒链。步骤锡（三解步）沾：DN牢A解链敞（变才性）引物暑与模谜板DN骑A相结页合（融退火运）DN济A合成靠（链盯的延闹伸）经不匪断重旺复循下环之吼后，败反应泥混合盘物中液所含体有的哈双链DN窑A分子般数（帮两条罩引物胡结合嫩位点篮之间峡的DN雄A区段许的拷氧贝数兰），劝理论讨上的辨最高挎值应桃是2n,实得1.冤8n（n：循搭环次绑数）杯。聚合影酶链诊式反友应（数PC隶R）最技术PC混R指乏数扩段增时杆循环尘次数郊与D袖NA膛产物箱数量规的比志较DN亮A解去链（锻PC能R的情第一歪步）弹：高构温处竖理将含迎有待敢扩增姑DN之A样壁品的买反应煎混合眼物放笨置在右高温白（>蒙94齿℃）筐环境疤下加有热1挨分钟湾，使厦双链单DN盖A变仰性，发形成绞单链干模板胳DN锅A。94鬼℃加捆热，晨淬火引物呀与模坛板D爹NA调相结损合（第例二步丙）：惕退火降低熊反应载温度巨（退脱火，俱约5帽0℃彩），欲约1哥分钟旧，使绞寡核朗苷酸傍引物轻与两畜条单踪蝶链模下板D静NA勇结合着在靶钉DN商A区瓶段两剑端的忧互补狸序列制位置尊上。50慌℃~豆60加℃，貌退火引物堵与模乞板D在NA灿相结扒合DN掩A合某成（鬼第三丽步）孤：将反援应混语合物苹的温鸭度上莲升到喊72℃左右凶保温款1-桶数分剑钟，椒在D浪NA肃聚合稀酶的浑作用倒下，御从引兄物的炉3'关-端肾加入隔脱氧裳核苷封三磷盲酸，榜并沿麦着模忌板分校子按藏5'悼→3偿'方饶向延瓣伸，缝合成水新生禾DN刻A互睬补链胖。PC援R扩伤增，马72锋℃左犯右,设按抓每分钟帝10已00凑个碱子基对深设计循环葛往复常规PC敞R技术甩能扩筑增两剑引物器之间疼的DN幅A区段仔，然劝而，模有时最我们来也希砌望扩捷增位尺于靶DN贤A区段素之外贵的未看知DN杠A序列唉，这熄就需所要应闭用反向PC楼R（re爬ve爬rs届e毕PC往R）技再术。先用业一种胆在靶DN惹A区段狠上没给有识着别位耳点的吊核酸弓限制肿内切裂酶，归从距兵靶DN仪A区段顽有一巧定距艇离的室两侧山位置价切割DN无A分子闻，然忌后将且这些认片段镇作分子眠内连泥接成环蜜形。颜根据有已知辱的靶DN延A序列阀按向外块延伸的要边求设蹦计一爆对向栗外引便物，垄保证瓦被扩示增的竞是位蛾于靶DN唐A区段堆两侧姿的未凶知DN锋A序列笑。反向榨PC丽R的费基本吩操作财程序拖。波纹军线表艘示靶每DN亩A区凉段，折箭头界表示贫限制柱性内则切酶蔬位点悟，分废别用刑方框闪表示怪靶D博NA慨区段却的左木侧和绕右侧弱序列鞭。用一迹种在醒靶序雷列上窗没有锋酶切发位点区的核弯酸限娘制性到内切蔽酶消居化DN震A；产生芒大小丘不同僻的线纹性DN影A片段字群体纽奉，其鲁中靶DN隐A区段隐的DN把A分子盲长度采不超察过2~狂3k睬b，经连崇接后停重新乓环化锯；按靶游序列肯设计筒的一宰对引旱物与海互补占序列锯退火伐结合洞，其属延伸温方向酱如箭该头所首指；经P世CR电扩增露产生掌的主武要是聪线性袍双链晚DN赛A分用子，触它是急由左基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7CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米师gl危ob捧ul坡in洒1不练同单凤倍型俱和基饮因型拢之间异的多棍态性晃比较据估局计，娘人类狭DN燥A中输每3贞00女-1立00吵0个睡碱基掀对就突有一孟个S伍NP袜，因芽此，顾一个杨人类共个体逼大约涌携带捐30章0万酷-1干00期0万财个S围NP波s。震位于秧染色删体上兼某一附区域党的一屈组相树关联贺的S世NP宝等位施位点援被称缺作单挡倍型子（h凑ap纠lo棚ty歇pe艘），束相邻首SN雄Ps追的等筑位位脚点倾漆向于辱以一燥个整印体遗催传给援后代勒。根据差SN斜P在卷基因缠组中给的分记布位寒置分米为编裕码区恼SN穴P（垄cS慌NP剪），个调控弱区S代NP垂（p宣SN愚P）阿和非斜编码朵区S韵NP悠（r机SN圣P）洁三类肿。编码寒区内菜的变绕异率当仅占吩周围君序列箱的1踢/5唇，c句SN迹P的答总量诱显著似少于运其它限两类随SN樱Ps冒。cS肚NP棉分为稠同义片cS党NP评（s挂yn鄙on惠ym赴ou朗s动cS晓NP宾），征编码些序列通的改也变不狼影响烫所翻火译的仍氨基攀酸序错列）卵和非蓝同义冒cS婆NP煌（n雪on说-s蓝yn析on小ym知ou践s停cS歇NP咽），破碱基停序列俯的改板变使搁氨基置酸序牧列发秋生改丧变，咐可能怒影响绣蛋白控质的浅功能瓦。5.脏4末.日2齿S品NP产的检休测技盐术通过戒DN每A测倾序法挂获得犁新的员SN秆P。基因击分型杠（g旧en恰ot誉yp逐in菜g）找是指榨利用拉数据作库中条已有蜻的S恼NP匠进行阴特定挑人群姐的序米列和负发生插频率狂的研重究，戏主要均包括梁基因形芯片刻技术泄、T嘱aq昆ma壤n技子术、辞分子姻信标进（m病ol累ec面ul秋ar片b帽ea邻co阁ns轻）技尊术和量焦磷斩酸测业序法筋（p兽yr管os墙eq马ue晃nc紫in鹿g）照等。1．喇基因垄芯片浪技术通过厘优化榆芯片出杂交递程序薯，使悬探针倍只与南完全汇互补莲的序欺列杂葱交而素不与夕含有支单个责错配寸碱基至的序菠列杂咸交。优点修是高讽通量易，一咽次可睛对多冠个S舌NP苍进行乘规模霞性筛歇选，咐被检么起始苹材料丛也很诵少，辩操作痰步骤牙简单膜。缺点查是芯胳片设社计成务本高界。而晴且，茎由于启DN览A样浓品的栗复杂插性，净有些轿SN停P不贸能被嫁检测诞。2．护Ta剃qm香an牌技术PC急R反蝴应系擦统中竖加入绕2种汁不同诞荧光歪标记茎的分片别与瞒两个鸭等位泳基因悼配对祥的探矮针。相随着筝PC显R的存进行锄，与壮模板仍完全恭配对楚的探具针逐民步被套Ta补q替DN锅A聚赢合酶划的5根’→广3’吵外切晴活性题所切宾割，始荧光轧基团易与3岛’端艰的淬习灭基浪团分革离，帮荧光蔑基团由被激踏活。围不完土全配毛对的源探针述（代蔑表另河一种钱等位麦基因蹦）不猾能被杀有效盏切割极，供膛体荧砖光基番团依族然被建淬灭们。3．丽分子撑信标炸（m灭ol湖ec看ul恋ar泪b穷ea附co兔n）斩技术是一崭种呈五茎环员结构舅的荧珍光标产记的雁寡核奋苷酸裁，环僚状区氏与靶另序列堆特异醉性结仓合，魔茎干此区由运5-耗8个有碱基葬对组臣成，鬼5’室端带柜有荧芒光发顿生基翅团，锐3’态端带达有荧兰光淬裙灭基摆团。柏自由似状态覆时，霸分子滤信标形呈发杨卡式爆结构收，荧链光几忠乎完司全淬役灭。汪与靶摄分子猾相结裳合时播，荧疼光基怪团和银淬灭桂基团养之间啄的距娃离增纷大，桃分子妈信标染的荧艰光恢紫复。Ta离qm诱an闭技术聚（上扰）及劫分子稍信标婚技术动（下尘）原轮理示捕意图缠。在多孔细胞陆的高新等生畏物个郊体水细平上箱，克挽隆表挽示由服具有君相同怖基因沫型的卵同一窝物种君的两弱个或昆数个升个体扔组成除的群徐体。浆从同余一受蚊精卵率分裂请而来上的单吃卵双矛生子较（m输on闻oz京yg齿ot航ic血t冻wi揭ns君）便灰是属怨于同转一克件隆。5.简5知基锹因克鸡隆（左cl樱on梳e）觉技术在细终胞水山平上但，克晃隆一攀词是哄指由坏同一窑个祖踏细胞狐（p尼ro繁ge冬ni根to渡r剂ce馒ll销）分念裂而良来的稀一群喉带有隆完全款相同堡遗传膏物质召的子除细胞环。在分咽子生撑物学腰上，踩人们蹦把将裙外源仅DN桃A插亦入具鞠有复覆制能堆力的白载体统DN戚A中沸，使裙之得饥以永即久保垒存和逼复制粗这种凡过程桶称为撕克隆伏。5.姑5演.凉1屑RA杨CE任技术林(r扒ap岗id服a荐mp币li知fi赵ca轨ti殃on法o顶f蜓cD监NA告e容nd稼s)是由睁Fr头oh湿ma碎n等吸(1库98瓶8)拌发明停的一敌项技肝术。宗是通荷过P触CR圈进行杯cD索NA夕末端捕快速模克隆南的技踢术，阻无须舱建立童cD顽NA佳文库可，可英以在漠很短扒的时微间内刮获得阻有利衔用价藏值的艰信息践。R须AC台E是剂基于侄PC缎R技尖术基圆础上霉由已踩知的强一段夫cD勾NA伐片段寇，通沸过往替两端去延伸婆扩增跑从而坛获得长完整获的3障'端换和5警'端御的方祖法。一般供分5去’阁RA固CE别和3柜’R垦AC车E两柴种：3-崇RA语CE判较简绝单，石首先郊将mR镰NA或总压RN羽A用鸦Po须ly汽T引物反转另录，步根据她一般蔬基因迫具有摸po健ly婶A尾幅巴的璃特点日，选牢用特划异引足物(织根据输已知膊序列萄设计隐)和杂Po堤ly群T引描物P绩CR素即可条。5-洽RA呆CE葡相对蛾较难纸，目伏前流利行几良种5觉-R零AC宝E。艳其一拨为加姑接头逆(传午统)统，根狗据接分头引桌物和务自己渔设计撇特异拥引物拦PC逝R，飞可以协设计搅巢式林PC绞R二厌次扩五增。闹另外技，有魔利用仔反向连PC允R技帜术，隶连接练成环蜓再P庸CR沈。巢式丈PC唉R（酱ne哑st桶P阶CR剥）：是指碗利用紫两套香PC天R引砖物（暑巢式献引物驴）进唐行两山轮P研CR嗓扩增屠反应肯。深在第牙一轮热扩增蓝中，外引愁物用以泡产生享扩增喇产物扫，此蝴产物弓在内引文物的存姑在下庄进行例第二屋轮扩脊增。禾由赛于巢庸式P菊CR央反应头有两答次P急CR投扩增茶，从劝而降哲低了迷扩增离多个乒靶位婆点的旬可能咸性（罚因为植与两袭套引今物都光互补料的引斯物很督少）诉增加照了检幅测的梳敏感棋性；部又有滔两对耕PC叠R引学物与包检测栽模板夺的配串对，沟增加傅了检按测的晌可靠淹性。优一外般应哄用于帜动物足方面秃。如笼：病舅毒，搭梅毒歉螺旋仍体，跌HI仙V，模肿瘤批基因锁等漫。5’黎R裂AC能E3’苗R请AC撑E利用杀mR遇NA源的3派‘末许端的宏po舞ly垒（A陶）尾替巴作赵为一堤个引筝物结晌合位榨点，卧以连芳有S堡MA尊RT疗寡核嘉苷酸污序列窗通用进接头废引物大的O瓜li职go吼（d剪T）穷作为浴锁定啄引物批反转污录合探成标勇准第服一链款cD院NA浅；再让用R迎Na瓦se春水解悉模板尘链；处然后本用一饼个基廉因特厘异引歉物G使SP戚作为燃上游瞒引物萍，用成一个忙含有如部分还接头驱序列疑的通映用引惑物U幻玉PM唉（u宜ni材ve植rs愉al六p冷ri鄙me链r）撇作为鹅下游搜引物展，以禁cD蹲NA俱第一鹿链为粥模板阔，进符行P枪CR蚀循环级，把凑目的想基因别3'莲末果端的杀DN景A片矿段扩绑增出烤来。RA顽CE乌的另镜一种兔代表练方法渣是自朗我连袋接法踩（S留el它f-字Li姥ga别ti朋on吉m乏et废ho凭d）1、酱反转谱录（死RT批）反武应2、富Hy誉br狂id垂R抓NA破的分朋解3、主单链锐cD宴NA贸的自晴身连昂接4、络PC棉R扩毕增5演‘未团知区末域5、饰目的阳DN柱A片郑段的焰切割规回收6、雅DN刘A序适列测加定5.纽奉5婆.啄2无cD茶NA谢差示顾分析馋法(R吓DA龄,缩慧Re筐pr鸽es和en帮ta窜ti切on述D神if立fe丑re枣nc茎e煎An汪al怠ys集is贴)充分术发挥下了P县CR今能以带指数扰形式奴扩增思双链检DN警A模造板，蛙而仅楼以线机性形敬式扩腊增单宴链模取板的耻特性中，通鸣过降吩低c狂DN铺A群娇体复股杂性贞和更架换c硬DN织A两躲端接灶头等纲方法矮，特畜异性吩扩增狂目的愧基因势片段岔。P异CR竿产物橡的特井异性尘和所面得的束cD未NA桶片段葱纯度伍均高。因为救Te堵st糠er筝和D词ri泻ve刷r在宽接受弓差示偿分析哑前均渔经一奶个4好碱基以切割铃酶处柜理，编形成吉平均煌长度顺25萄6b棒p的滴代表菜群，失保证梢绝大册部分层遗传冈信息示能被鞋扩增肯。5.热5宣.饮3旦Ga窜te乱wa胜y大菠规模采克隆简技术Ga山te摧wa索y技船术利谱用λ磁噬菌牵体进徒行位薄点特闷异性暴DN形A片留段重磨组，用实现弯了不摄需要引传统如的酶抵切联距接过住程的佣基因犬快速啦克隆耕和载飞体间和平行承转移率。Ga吉te靠wa群y大宴规模泼克隆骗策略TO抵PO蹲反应貌:将目莲的基鹿因P拢CR敢产物流连入任En叼tr矮y载醋体。职载体残上的赔CC加CT磨T被塞拓扑犬异构宽酶所赛识别餐，通遇过与膛切口篮处的瓶磷酸前基团贵形成虚共价光键，揪将该橡酶偶匀联在芬载体砖上。林5’崇GT陪GG我粘性弟末端批攻击毯PC尝R产歼物的民互补镜性末拨端并详与接起头序宏列C耐AC腥C退梯火，果使P差CR才产物价以正泥确方哭向连仔入E殖nt弃ry飘载体飞。（玩见图馒5-粱24厚a大P盼18郑6）LR忽反应稀：将目惨的片晚段从昏En扛tr巷y艘载体照中重陶组入抽表达翼载体匪。E王nt街ry辉载体货上基房诚因两革端具株有a欲tt些L1维和a冬tt帮L2靠位点踢，目竭的载当体上庆含有刊at非tR傍1和千at猪tR逐2位舅点，轿在重单组蛋访白的狡作用铁下发鉴生定喷向重右组，惩形成赢新的词位点评at戚tB芝1和巷at浸tB怀2，东将目赵的基自因转涂移到角表达艰载体仰中。饺（见舒图5爽-2敌4b额P1旨86骄）5.镜5幸.杨4圆基因诸的图弯位克洁隆法共（M泪ap养-b忙as腊ed千c喂lo上ni邻ng托）所有葵具有顾某种主表现蝴型的望基因烘都可纱以通洁过该堡方法棍克隆母得到庄。通过梯构建照遗传循连锁罢图，麻将目齐的基妇因定蹈位到防某个亚染色水体的雷特定岂位点即，并勺在其梁两侧全确定御紧密貌连锁亡的R托FL员P或买RA严PD你分子况标记哥。通过停对不郑同的台生态求型及仿限制竞性内孝切酶寇和杂雷交探框针的狮分析炮，找疗出与趁目的情基因意距离穷最近混的分痒子标干记，浙通过配染色标体步缴移法企将位酿于这进两个动标记卷之间醋的基植因片阔段克唉隆并研分离隐出来火，根折据基鹿因功委能互扰作原半理鉴欢定目习的基职因。染色汁体步躲移法混克隆之基因融示意屑图在R弓FL领P作啄图中妈，连失锁距采离是配根据致重组辞率来串计算深的，韵1c党M（点厘摩跨）相稀当于折1%伏的重搏组率膛。人掏类基法因组章中，离1c淋M≈荐10巧00箩kb狡；拟温南芥卫菜中感，1外cM买≈2丘90伪kb升；小筐麦中签，1宋cM疼≈3届50秤0k付b。用图绝位克搞隆法晨获得沟水稻沟脆杆铲基因BC龄1将BC使l定位拐于水语稻3号染瓶色体厌（Ch搜r3）分子处标记C5艘24泥a和RM弃16之间津；B.覆盖BC剖l位点屡的BA显C大片跳段。C.织B演Cl位点谅的精沾细定蔑位。BC奶l位点凯被定编位于兔分子弊标记P2和P4之间缝与P3共分桐离。D.补B阅Cl基因燃结构艘。红已色为镰编码炕区，巾白色育为5’和3’非翻些译区倒，黑周色线座段为捉内含循子。bc照l-亚1和bc司l-千2表示拾两个裕突变晴位点多。Li属,伏Y.香,哑Qi蓝an舱,绍Q.纤,各Zh病ou阵,革Y.猜,桂Ya赞n,指M径.,抹S皂un辉,草L.业,Zh课an培g,腰M书.,找F含u,博Z俯.,技W浴an健g,露Y逗.,肚H戴an猴,绍B.不,勾Pa藏ng宋,尖X.验,纵Ch愧en荣,露M.张,塑an妨dLi类,壮J.(2伐00劫3)欠.逢BR锹IT宗TL袭E集CU狡LM另1,绩w絮hi上ch及e亲nc着od段es或a虽C荡OB早RA忠-l码ik宇e铜pr鹊ot吹ei欢n,交a纳ff殿ec税ts烫t茧he浸m灾ec虾ha货ni浸ca锁l办pr巷op蝴er病ti吓es贱o亲f似ri屯ce皂p瞧la匪nt财s.Pl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