第六章 蛋白质的分离纯化

第六章

蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质蛋白质中的功能团

末端α－NH2

末端α－COOH

侧链基团

所以，蛋白质的化学物理性质＝AA

A．蛋白质是两性电解质，能和酸或碱发生作用。

B．蛋白质分子的可解离基团来自侧链上的功能团。

C．结合蛋白质辅基成分包含可解离蛋白质

D．末端α-COOH,α-NH2

E．蛋白质分子中可解离基团的pK'和游离AA中相应基团的pK'值完全不相同。

∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响

F．蛋白质可看作一个多价离子蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零。这一pH称为蛋白质等电点等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质质子供体基团界离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称等离子点。特征常数。二．蛋白质分子的大小与形状

㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量

㈥．利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量蛋白质在各种介质中（PAGE）电泳时，它的迁移率

这样造成两个后果：①SDS为阴离子，多肽链覆盖上相同密度的负电荷超过蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

因此，所有SDS-蛋白质复合物，电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极移动。

②改变了蛋白质单体分子的构象。SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的分子量而成正比例地变化。

电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有下列关系(七)毛细烘管电突泳测辟定蛋驴白质稼的分脉子质碧量毛细经管电迫泳（CE）则可爹以在宁很大乖程度鼓上克缠服常贱规方脆法时低间长冷、灵祖敏芽肥低不败利情劳况。感用毛梦细管虹电泳呀测定估蛋白桶质分赢子量暗仅需泊要纳茄克量烫蛋白符质，遍而且胞还可采以用眯积分展仪或圣电脑阵联机轧精确派定量点。(八)质谱黄测定醉蛋白辉质分五子量质谱伸测定痕蛋白季质分践子量驴是近参年来腾发展血的一县项新陶技术秘，其继分辨要率和垒精确鞠度都绝较前咐几项曾技术赶高。恐尤其坑近几何年发见展起宏来的俱磁质株谱可许精确晚测定狭分子亡质量20树00刚Da以下碰的多盈肽；钥而电宴喷雾益质谱恩（ES欧I）可以补测5万Da的蛋敞白质丘，而狱且只吩需要态皮摩诱尔（pm惹ol）量的汽蛋白玻质，薯精确揭度为0.潜01寒%。三．庄蛋白唉质的迷胶体亦性质局与蛋吗白质帜沉淀1．蛋汽白质掩的胶劣体性遵质蛋白嫩质溶显液是栗分散姑系统：分冈散相迹是蛋挨白质委分子习颗粒视，分冷散介飘质是臂水。分散燃程度--能--熊--掀-胶体哪系统分散龟相质说点--臣--矿--痕--真溶六液（质炼点是躁分子箭，均吨相系欣统）分散伴程度--以分速散相姐质点动的直言径来聪衡量根据劳分散延程度匹：分散毅相质由点在陈胶体庆系统长中保不持稳痰定需款三个捡条件榴：a．分散香相质扭点1-保10闪0n究mb．分散衬相质葡点带涛有同晕种电虾荷，被互相纤排斥吨不聚储成颗饺粒而砖沉淀c．分散赛相的油质点和能与粒溶剂涌形成届溶剂虏化层蛋白最质：a.胶体校质点朵的范呀围c．丁达姐尔效岁应d．布朗废运动e．不能崇透过尼半透毯膜2．蛋膛白质自的沉吗淀沉淀揉蛋白挥质的徒方法去：①挪盐析肤法：中性刷盐（NH4SO4，Na胡SO4，Na罪cl等）奋－→螺蛋次白质纺脱去添水化御层算优点罩：不剑引起挽蛋白梢质变焰性②芒有机傅溶剂似沉淀赴法：极性屡有机欠溶剂戚（甲帅醇，照乙醇渴，丙仍酮）鲁－→挖脱去浪水化固层以孕及降栽低介锦电常陆数而创增加蜜带电未质点雨间的达相互峰作用条件牧：低粮温操民作贫缩短迫时间③水重金袋属盐奏沉淀雁法扣当溶侧液pH暴>pI,蛋白统质颗养粒带农负电去荷,易与构重金桥属离各子(H酬g2忍+,颗Pb径2+农,C悟u2脸+.赴Ag凳+等)－→垮生成铁沉淀用途因：抢传救误絮服重晃金属皂盐的唱病人④生物闭碱试第剂和提某些禁酸类钳沉淀蔬法生物易碱试茅剂－李－能革引起炸生物惧碱沉摘淀的昆一类晓试剂当溶眠液pH婶<pI时,蛋白堵质颗嫁粒带脑正电绪荷→易与耀生物逆碱试爬剂,酸根多负离豪子反浅应→沉淀用途奥：临米床除系去体辨液中间干扰思测定漏的蛋烤白质⑤加热为变性啄测定拿法原因衣：a．加热筹变性教使蛋仁白质延天然拌结构偷解体疫，疏亲水基馅外露葡，损升坏了乏水化家层b．蛋白冷质处线于等亲电点确破坏胸了带抹电状价态。富用劳途：踏制豆宅腐（凤加热+少量浅盐卤猴）四汽蛋白钞质分有离提神纯的昌一般叼原则蛋白申质提次纯的燥总目项标--增加宾制品轿纯度臭或比重活性该、几坏增加所单位嫩蛋白延质质航量中土所要欠蛋白隙质的丧含量炒或生科物活与性。①却前处宫理：材料朴获得馋：（一第）天强然材给料：新鲜精，含爹量丰丙富，天易于陪提取手，价黑格便埋宜。e.今g.钙调肾素：动物柔的脑打组织透，植刚物花努粉胰蛋敞白酶藏抑制筛剂：大豆貌种子溶菌划酶：鸡蛋貌清抗体越：血清（二赴）基朴因工影程产喊物：对于终天然忌不易茧得到差的蛋寺白，修通过习工程菌我或工惯程细因胞表姥达而墙获得歉。②让粗分猴离蛋白阶质混插合提颠取液嫩训车∣叨猎∣尼盐析撞法、顺等电预沉淀夫、有敌机溶窄剂股妖↓答所激要蛋护白质罩与其吗他杂舞蛋白宾质分从开特点浓：简忆便、绸处理姜量大销、既慌能除李去大姓量杂连，又蜻能浓缩蛋疾白质娇溶液。粗分顽离（一脊）破馋细胞动物黎，植勺物细榜胞：匀浆个，研敲磨大肠谅杆菌晨：冻融际，超歉声，逼溶菌偶酶（二堂）抽锣提1.pH：选择王合适pH的缓壮冲液漫，如Tr磨is，磷酸咸盐，笛醋酸昂盐，僚柠檬扒酸盐问缓冲纹体系册，保岛证待辨分离袋蛋白香在此pH条件移下稳块定。树一般朴缓冲衔液浓袜度为20－50捞mM。2.温度：低温衰如4－10渣℃，蛋绣白酶超活性制较低军。3.离子舒强度：如0.浊1－0.敬2酸MNa物Cl或KC冰l.4.其他俩成分：还原蛇剂如Na吗HS积O4，维生靠素C；巯基斑保护配剂DT晶T，巯基沉乙醇巴；金颂属螯乒合剂ED聚TA，EG江TA；蛋白泰酶抑稠制剂PM管SF。（三烘）初秋步分灯离1.分离仗细胞堆器：离心木，超守离心2.除核爪酸：酶法DN矩as瘦e,筐RN刑as威e；超声3.除脂娘肪：丙酮顽，脂刚肪酶（四街）粗肝分蛋像白1.盐析座：Na庆Cl，(N污H4)2SO4沉淀2.有机容溶剂没抽提娘：甲醇染，乙包醇，拆丙酮3.等电惩点沉扰淀：除去拴杂蛋效白4.热变岁性：除去健杂蛋井白（五餐）除靠盐1.超滤2.凝胶脊过滤3.冻干③细分川离④结晶困：本身杆伴随肥着一虾定程翠度的暂提纯重结课晶：可除状去少领量夹什杂的卧蛋白绩质湖蛋白师质纯脂度愈馒高、面溶液思愈浓元就愈券容易沈结晶五滤蛋白浙质混明合物忧的分蹄离方禁法(一）堪据分逆子大奸小不完同的械分离槐方法1．透伟析和盈超过踪蝶滤利用守蛋白吨质分郑子不腊能通易过半犹透膜触的性签质，完使蛋磨白质绩和其帖他小休分子辽物质握如无谋机盐布、单而糖、戒水等朗分开钟。超过乔滤利用坦压力狗或离脂心力粪，强薯行使愁水和考其他市小分分子通为过半劣透百膜，炊而蛋筝白质凝留在常膜上闲。2密度绘梯度稍（区泛带）庙离心原理3凝胶拌过滤（凝图胶过僻滤层撤析，目分子胃排阻荣层析漠）（分挣子筛扩层析彼，凝葡胶渗逐透层六析）鼠集--境--暑--亮-根据泰分子银分离律蛋白暴质混外合物⑴溪凝胶孙过滤葵的介盖质常用辽介质长：(1无)Se醒ph颠ad翁ex:扛(交联雄葡聚爪糖)漠G2他5,黎G滋50壁,未G7糟5,浴G迈10波0Bi毅o-降ge填l:萌(聚丙勤烯酰嗓胺)伟P-马6，P-睛30，P-艳60，P-炉10站0Se观ph崇ar盼os能e:梨(琼脂未糖)抖2B抱,诞4B物,锤6B(2抚)Se蚂ph挎ac交ry违l:梅S1没00拳,蔽S2腐00烦,桌S3嫩00(3营)Su回pe袖ro纹se:惰HP律LC(4洲)su牌pe巴rd拜ex:遇HP化LC凝胶庆珠--多孔薄的网题状结虎构交联丝式度or孔度（网虎孔大毁小）吨－－决定甩凝胶膛的分忌级范得围，顽即能吉被该请凝胶垃分离伙开来税的蛋玩白质涂混合喊度的闯分子管量范律围。排阻挥极限－－表示雕分级克范围赴的上列限，猾不能俯扩散止进入古凝胶栋珠微内孔的盾最小是分子晨量的韵分子插量。凝胶观粒度--筛眼殃（目偿）数尊，珠闲直径点表示财∣－－→与洗刊脱流巡寿速，狡分辨骂率有纲关⑵幕凝胶纸过滤烈的原迅理当不惯同分搁子大族小的子蛋白烦质混若合物蒜流经臣凝胶吐层析拖柱时陶比凝戴胶网宣孔大煎的分遇子不竖能进丸入珠日内网辽状结兴构，卷而被颗排阻凑在凝平胶珠暗之外接。随着诸溶剂此在凝箱胶珠夹之间估的孔戒隙向锹下移旱动并虑最先玻流出宏柱外雁；比低网孔秘小的焰分子纪能不丙同程蜡度的排自由身出入阳凝胶锣珠的管内外叔。不同积分子膝大小漂路径挪不同大分壳子--先洗度脱出峰来小分凳子--后洗喝脱出圣来有关志凝胶仆柱体仙积的帆术语Vt为凝港胶柱扩床的区总体烟积（to吹ta猾l西vo泻lu汇me），常称淡柱床群体积治。它可良以用塑水直挤接测蒙量或鹿按几惑何形减状计与算而镜得。堪Ve为某地一溶违质组晕分的柴洗脱胁体积位（el即ut蚕io盈n亩vo群lu敌me）。它是严自加溪样开貌始到厅该组糖分的恢洗脱池峰或袄洗脱些峰上夜升边谦缘的属半高兴点出惠现使肢所流辽出的抢体积柴。V0为孔琴隙体惨积（vo甚id猫v绸ol枪um膝e）或称弃外体胀积（ou纤te脸r度vo蔬lu妥me）或外堆水体慢积。测定悠不能饥被凝节胶滞堆留的筹大分玻子溶冶质如座蓝色柜葡聚湿糖（bl肿uede颂xt导ra佳n，分子傅量约20申0粮00喇0）的请洗脱判体积止可以检决定V0。直径匙均匀已的刚券性球筹形颗梢粒的祖柱床V0约等刘于0.选35坛Vt。Vi为内允体积督（in导ne陈r啦vo家lu嘴me）或称冰水体惰积，它烛可由药于胶小克重其乘其饶吸水捷值（耀以毫想升/克表畅示）扒近似汁地表型示，蝇或直午接测应出凝游胶柱泽小分葬子物蠢质（扬如T2途O，tr章it算iu园m哨ox葵id残e）通过棉的洗孩脱体扬积再匪减去奴外体漆积得瓶来。Vm为凝哥胶基弊质体尖积（ma算tr舍ix徒v纠ol闷um遣e）。凝胶不床内撞各种尊体积宇之间羽的关德系是鼻：般牲Vt=挨V0+甚Vi+Vm其中捆，（Vi雄+Vm）亦即陵（Vt柜-V扮0）是凝编胶珠赴的总滋体积荷。假定但凝胶俊与待亭分离块的溶钓质之滔间不单存在颤相互详作用帐，那夏么凝辱胶过艇滤可追以看赚成是校一种希液-液分汇配层逢析。帖凝胶炼珠内近的水划相是混固定脏相（Vi），凝胶柏珠外拒的水归相是即流动目相（V0），溶质爆在Vi和V0之间引分配妄。能银进入Vi的溶君质的撞量决埋定于束它的朽大小拒和凝驱胶孔便的大在小。欧溶质友在柱忽中的睬移动泳速度锋取决叮与它慨在两准相之粒间的历分配靠系数斤（Kd）：Kd是溶预质分疮子大辣小的日函数沫，而韵与凝迁胶床剪的几鸭何形偷状无骡关。狱对于康完全课被排驴阻在滤凝胶艇珠内誉外的筑大分撞子来池说，虾它们摔将在眨同一圆洗脱加峰出墙现，Ve=献V0，Kd=0；对于喝完全矛能自惧由出圈入凝油胶珠王内外款的小敞分子对，Ve=甩V0仙+闹V支i，Kd=1；对于验在分爽级范厅围内枣的中微等分首子，租凝胶五珠内临部的矛有些沙微孔庄它们欧能扩拖散进罪去，仔有些枕则不寇能，却因此稼一般吉情况蔑下，Kd总是纸在0与1之间贡。但有港时发痕现Kd＞1，这表佳明凝篇胶对予溶质拌有吸便附作浮用。堤整理料上式管得：刺鬼居痰Ve=酸V0揭+KdVi寇从这抚个式秀子可触以看愁出，歇某一哲溶质钩的Kd就是纠该溶教质能圆扩散探进入鹅珠内泡的空乎间部脱分占锹其总米空间唯（Vi）的分蛙数。由于承实际姥测定Vi有困摆难，崭所以秘上述扮的公红式很代少使那用。舞经修怖正，诉用凝还胶珠想内的脱总体达积代钻替上歪式中脱的内欺体积疏（Vi）来表众示Kd，此时Kd改用Ka抢v，称可温用分孝配系雁数（av不al铸ia典bl订eco格ef况fi陷en努t）：只要缝测得Vt，V0和Ve，即可保计算Ka晋v值。对于鼓两种魔不同渐分子验量和裕不同Ka具v值（K‘弟av和K’摸‘a衫v）的组嗽分,它们嚷的洗愿脱体芒积之顿差：Vs搏=V在'e晴-V星"e绍=（K'点av什-K徒"a叉v）（Vt渔-V技0）因此,为了窜完全躁分开娱两种昂组分,样品宵的体抄积一骂定不伞能大苦于Vs。上面行这个颠式子来可以穴用来锐计算霜某一阔提纯萝过程趟的最苍适柱架床体泼积。处理已介质↓装柱↓平衡↓上样↓洗涤↓洗脱↓介质并再生层析唯的一疮般步烘骤(二)利用险溶解丈度差接别的父分离办方法等电戏点沉派淀和pH控制蛋白院质处廉于pI时，网净电累荷为杯零。爽沉淀歉溶解况度最私低吓pH资>pI蛋白让质带危电，泼溶解饼度较泻大疑pH避<pI1．不同盼蛋白始质遣眨组∣逗夜种↓物赵等电僵点不井同抹眨鞋∣旷社听∣pI时溶哲解度打最低呀出猾↓估奥将蛋衫白质歌彼此宁分开2．蛋坊白质虎的盐揭溶和绳盐析刮中静性盐宗对球商状蛋次白质诊的溶不解度袜有显型著影矩响高低接浓度活时，虫中性屈盐可迹以增蛋加蛋俯白质扒的溶屿解度卖盐歉溶那作用戚机理障：蛋计白质挽吸附细盐类笛离子阶，带吊电表践层使疏蛋白辽质分介子被燃此排仅斥，陕蛋白趣质与苦水分册子的仇作用膨加强勾，溶莲解度丸提高炉。同胃样浓屈度（扣摩尔粮数/升）袭的两蚁价离迫子的高中性矩外，枪如Mg绒Cl2\（NH4）2SO4对蛋葛白质毅溶解魂度的航影响谦效果现，要年比单任价离粱子的辜中性睡盐如Na电Cl扫,N羞H4Cl大得思多。盐析扰－－嚼当离左子强午度增伸加到瞎足够镰高时葬，eg.饱和狮或半伸饱和属程度铁，很炒多蛋巾白质进从水摄溶液奖中沉异淀出掠来，喉这种差现象湿叫盐咐析。原沫理－耽－大破量中脸性盐岛的加祸入，芬使水稍的活净度降胆低，别原来摄的溶趁液中清的大袋部分尤自由弦水转改变为盆盐离顶子的课水化董水。古降低茶蛋白落质极津性基条团与耗水分签子间硬的相竭互作访用，腐破坏袭蛋白瞒质分屑子表啄面的珍水化南层。盐析袍法－更－分苹离、伙提纯顽常用钩方法敏。保届持蛋倘白质它的天冒然构爽象。疏（NH4）2SO43.有机缩慧溶剂凉分级迷法作用浆原理蹦：①.有机溉溶剂龙的加惹入改巩变了社介质婆的介善电常绢数，宗增加复了两棍个相季反电像荷之运间的清吸引诵力，仰。蛋伪白质杰的表芬面可网离解臣基团且的离批子化宏程度蹦减弱侨，水传化程预度降厨低，扣蛋白州质分抽子聚呼集沉顿淀。②.有机简溶剂犁与蛋唉白质固争夺骆水化齿水，耗致使盟蛋白挡质聚横集体庆的形鞠成并环沉淀小。聚乙秘二醇盗（水近溶性孟非离卷子聚倒合物蛙）可伸致使肠蛋白湾质沉悼淀。原理毙：脱点去蛋和白质柴的水冷化层肿；聚债乙二朗醇与功蛋白宝质亲眨水基碗团发牙生相括互作龄用，鸡并在担空间碎上阻室碍蛋捉白质普与水至相接复近。蛋楼白质塔在聚扰乙二帝醇中相的溶嘴解度究与盐弦浓度雄，pH，及绝歼对溶袍解度叔无关泊。其渐溶解渗度依筝赖于特聚乙傲二醇堵的分殖子量根。4．温叉度对缸蛋白役质溶最解度你的影笛响。0-腥40摄氏眯度桂大部降分球阻状蛋每白质岛溶解惊度随惨温度匠升高柿而增筐大傻40国-5台0摄氏酸度卫大部冒分蛋挥白质害变得泊不稳粉定,开始麦变性董奔大多狸数蛋块白质届在低服温下帖比较伴稳定,蛋白辞质的袄操作息在0摄氏寸度或漫更低湿温度奶下进漂行.糜蛋站白酶,胰蛋破白酶或及其姨前体差的制仁备(三)根据恳电荷邮不同株的分寻离方挠法根辉据蛋躁白质病的电断荷不酱同即因酸碱毛性质辩不同疏分离陡蛋白捐质混备合物乡丰的方诉法有电泳拍和离森子交封换层日析两类突。详1．电怨泳在外毕电场他的作屯用下害，带纲电颗岔粒，之例如析不处谅于等哭电状身态的品蛋白轰质分锄子，艰将向非着与狼其电胳性相屯反的租电极笋移动它，这窝种现辟象称保电泳(el英ec掌ct浙ro箱pH妄or凭es徐is)或离芒子泳(io饮np伞Ho蔑re照si口s)。或从棕方法定学的帽角度痛给电辜泳下蒙定义椅，电着泳是叔在外虾电场正存在默下，佩利用庄分子胀携带砖的净衬电荷且不同浴分离益分子享混合迫物的败一种茎实验秒技术殖。电淘泳技续术可吵用于摩氨基场酸、拜肽、炮蛋曰医质、炊核苷尚酸和何核酸娘等生授物分经子的纤分离路分析雄和制贯备。带电捆颗粒纵在电件场中双的泳充动速被度主梳要决份定于越它所脾带的扩净电碧荷量评以及截颗粒荡的大故小和狮形状杰。颗忧粒在万电场阀中发忙生泳葵动时减，将衫受到炎两种袭方向滚相反伴的力厌的作刘用：絮钓币F(电场娇力)=qE(=qU范/s)漠双售Ff贫(摩擦扮力)=念fv这里边，q＝颗粒般所带赠的电折量垮广E＝电场悉强度饰或电怀势梯发度＝U/闪q门链U＝两电西极间绣的电慌势差(以伏淋特表雨示)寻微S泄=两电乔板之殖间距典离(以厘诵米表宜示)互讨f＝摩擦恶系数(与颗暑粒的因形状确，大蜘小和旨介质忙的粘字度有话关)乓纤v＝颗粒踪蝶泳动亩速度(以厘跃米／隐秒表夺示当颗楼粒以棍恒稳葵速度协移动器时，骂则F-趁Ff嫂=0，因此揭，qE=F住v，即，考插抬毛究v/爆E=敲q/铃f在一泰定的沃介质狂中对就其一融种蛋态白质州禾说再，q/紧F是一押个定捉值，习因而v/锁E月也盖是定成值，竟它被政称为陈迁移鹅率或赌泳动讽度：编熟垦单饥u=往v/哑Eu值可寨以通鹅过实雷验测版得，橡蛋白闯质的u值为0.挠1*窄10抚-4摔-剖-1今.0滥*1挥0-材4厘米2·伏特-1·秒-1。蛋你白质颠的泳挣动度穗以及pH和离掠子强懂度对阵泳动爷度的物影响形都反战映某张一特矿定蛋薪白质乱的特多性。剖因此套电泳裕不仅呢是分涌离蛋末白质爷混合王物和纳鉴定特蛋白愉质纯毛厦的解重要蔬手段句而且橡也是康研究垄蛋白羡质性往质很广有用柿的一屡种物贡理化跃学方瓜法。电泳段基础持：自由机电泳与（移达动界蛾面电晴泳）a.先在u-形管喉内使速蛋白欣质溶芒液和杨缓冲及液之丹间形倚成清参晰的浸界面毯参b.加电侧场总c.由于仓界面降处存氏在浓脱度梯摇度，巴因而靠产生幻玉折射丛率梯见度。看利用馅光学业系统敲可以及观察护到界盒面的身移动赛。每盖个移干动界名面相跪当于胆一个维特定议蛋白款质。区带雹电泳是由兰于在蜜支持征物上疮电泳罚时各零组分虾因迁阵移数桨度不倾同分来布成蜜区带夹而得担名。按支祥持物迅介质指的物间理性脂状：的四类返区带距电泳势：1.滤纸套电泳.薄膜冬电泳(醋酸差纤维觉薄膜瞒电泳,薄膜禁电泳)让2.粉末惧电泳:淀粉.纤维旱层.硅胶端粉3.细丝脾电泳:尼龙鼠丝,人造勾丝4.凝胶蝴电泳:聚丙怪烯酰凯胺.琼脂哭糖凝盈胶盘状胜电泳在区名带电恒泳基腔础上俊发展秤起来逗的。拾支协持桑物屠－－忠聚丙大烯酰印胺凝纯胶三种退物理腿效应焦：1。样幻玉品的雷浓缩射效应镇鱼猜皆2。凝告胶对沟分子屯的筛楚选效展应疏搬饼园3。电戒泳分朽离的曾电荷斯效应样品冲分离墓效果马好、亏分辨津率等辱。等电扣聚焦艇（电勿聚焦叛）蛋白庭质混狸合物河的分判离是道在具番有pH梯度扬的介畏质中拨进行愿的。用聚此丙烯刻酰胺姿代替沉蔗糖蠢溶液淡介乔质固菌体化永、操策作方变便、规分离搁快趴蛋白应质"聚焦"在等肢于其智等电惹点的pH点处陡，形后成一逆个很砌窄的络区带扫。双向们电泳--称AA混合端物一域次电兰泳不并能完伴全分锈开,将第找一次对电泳挥分开侍的斑灶点通拼过支扑持介起质间拼的接镰触吸箭印转吼移到嘉第二脸个支献持介淘质上,旋转90镰℃进行卧第二牛次电艘泳,称双及向电晌泳.优点:设备偶简单.操作宵方便,样品追用量撇少19辱75年，O’侍Fa抄rr世el托l首先售运用协双向择电泳闯技术灰将大伐肠杆喂菌总驾蛋白列分离飘出11净00多个快蛋白柏点。肚后来斯此技在术一舍直用进于原敏核生妇物和姨真核两生物低总蛋档白的棍分离浅。目甘前，锐随着顽蛋白列组工俊程的踪蝶发展抓，双飞向电萄泳技程术越贩来越掏广泛竟的用卧于发闹现未阿知蛋纷白。双向棋电泳青由第悉一向骆等电法聚焦(I稳EF餐)电泳携和第岩二向SD候S-聚丙扶烯酰森胺凝停胶电悉泳(S纹DS目-P地AG较E)组成辈，第地一向铜使等孙电点肾不同厚的蛋晚白得瞧到分孔离，帅第二熄向使攀分子巧量不想同的摸蛋白珠得到权分离毙，两扶向结完合便搭得到晨高分宪辨率椒的蛋冶白图匙谱。2．县离子歉交换宰层析原理篇：根据村蛋白皮质等喂电点宰的差焦异将练不同瓶蛋白巴质分湾开。离子菠交换蔽介质肉：(1拥)离子乏交换满树脂(2订)离子愈交换吼纤维虚素(3规)S龙ep益ha渣ro熊se邪F楼as迁t五Fl饶ow杀:(4是)S呆ep房诚ha弹ro握se蒜H祸ig剩h谱Pe陵rf拣or筋ma生nc狐e：分辨煎率较F.脆F.高(5铸)M晚on究o:畏H虫PL阿CI分类猎：阴离帝子交蜡换革强度贪功能碗基团+DE聪AE中等田－OC攻H2CH2NH演(C无H2CH3)2+QA己E强捕－OC胖H2CH2NH犬(C弊H2CH3)2CH2CH3阳离浆子交遗换寇强度编功能脚基团CM弱向－OC秒H2CO煮O-SP强效－CH2CH2CH2SO3-II选择层：i根据抗蛋白剃质的编等电电点选爸择介瓜质ii根据如分离群目的顺选择坚介质例如恶：离子露交换佣纤维姨素――纤维薯素为想交换秆基质原理合：具殿有松捕散的行亲水信性网味状结罪构，神吸较仁大的稳表面固积，团大分阴子可术以自日由通徒过优点担：茂交换诊容量核大题洗扭脱条陡件温握和汤回侍收率旬高丢品凳种多芹，选惠择范窝围广离子灰交换应葡聚谊糖――基质遵：交他联葡冰聚糖优点丸：交换滑容量喝比离抬子交滤换纤森维素咐大3－4倍。能根世据净电跃荷铃分子护大小分离蛋白宫质混毒合物命的分魂离由溶液推中的摆盐离铜子强叉度pH来完维成结合铲力小认蛋白遇质先弦由层积析柱鄙中洗加脱出尺来洗脱批时保持搜洗脱嗽剂成插分不绣改变喘改变词洗脱善剂的碰盐浓帽度、PH值跳跃框式分信段改戒变（殊分段霜洗脱洒）渐进姜式连没续改介变（若梯度计洗脱顽）绝梯度代洗脱脂优点骂：倦分离爽效果拨好惧分辨跨率高慌适枝合：嗽交换桨容量长小，齐对盐千敏感摔的离注子交叮换剂两种秤混合柔器:简单浊型混夹合器复合泪型混固合器注意陆的问吨题：(1禽)缓冲尖液的壮选择：阳离命子：Tr琴is阴离卸子：疤磷酸泳盐，考柠檬湖酸盐(2承)介质派处理河：阳离薄子：Na+型阴离乔子：Cl-型(3渡)洗脱车：原理知：i改变染盐浓伐度ii改变pH值方式队：i分步蒙洗脱ii梯度誓洗脱(4抗)介质腰再生（四拖）蛋势白质暂的选营择吸智附分曲离吸附冠层析--利用概吸附煤力的栽强弱顾不同艳而达摩到分庸离的颈目的抬。够吸幻玉附剂--结晶歉磷酸恩钙及房诚羟基重磷灰亚石寺蛋凝白质劫分子序中带捧负电公荷的凳基团挑，与瞎羟基鹿磷灰费石的章钙离洽子结烟合。嫩用磷哀酸缓修冲液删羟基塞磷灰爆石--分离购核酸采：病承毒。墨活性C硅酸AL知2O著3磷酸予钙--吸附感层析（五气）根贡据对盼配基博的生英物学俘特异妄性的贴分离子方法--亲和龟层析基础房诚：基于沸蛋白停质所涉具有薪的生懒物学抬特异渗性。舒（它赤与另冤一种浮称配恶基的罪分子催能特包异而姜非共惕价的贪结合迹）配基位：能被谣生物曲大分住子所宇识别陕并于凝之结枪合的俭原子董，原骄子团唤，和贼分子杀：酶--底物;激素--受体祖；抗仰原：菠抗体。原理先把箱待提致纯的评某一吴蛋白尼质的臣特异漠配基淘，通趟过适惹当的金化学鞠反应洽共价恩的连袄接到们像琼荷脂糖难凝胶医一类网的载体体表视面的厕功能维基上命，在城配基肌与多暗糖基你质间属迁入秆一个泉连接扩臂使借配基悔于凝陶胶之验间保挪持足唤够的仓距离供，不趁改变租载体倚表面阵的空输间位混阻妨搜碍等粗待分厕离的换大分奏子与胃其配猾基的封结合袄。待提皂纯的祝蛋白此质样市品+多糖材材料查笨理↓待提糠纯的舰蛋白晋质样大品与溜配体结合散，吸捆附，疏在琼坦质糖鲜颗粒虏上难尊↙欧臣真突↘结合茄在柱衫上的联蛋白铃其它横蛋白指可膀以用阵自由屯配体繁的象分子态溶液武脱下瘦来1原理亩：利用脸蛋白否质特狸异性读进行葛分离姓。2介质进准备迫：载体罩选择谅：Se航ph疗ar吊os贯e4BSe掀ph扣ar膏os烧eCL碗4B瓶,Se社ph聋ar涌os趣eFa断st志F捕lo筒w,Se语ph课ar屋os雁eHi俱gh缘瑞P晶er胳fo关rm举an雾ce空间饶臂：偶联偶小分见子时居需要亭空间盆臂，爆常为申双功飞能基环团，躁如己斗二氨前或ε－氨基渡己酸蜜。3配基派选择数：抗原――抗体料，酶――抑制互剂，疮酶――底物闷，激辉素――受体监，金标属结驾合蛋躲白――螯和考剂，剃含早巯基马蛋白――唐Hg或含旨巯基蜻分子抱，凝长集素――糖蛋取白4偶联块：I溴化勺氰法：与α－氨基昂或ε－氨基旦偶联赴。效率箭高，弯反应踩时间娘短，撒条件矿温和唉，适怠于多件种蛋纽奉白。II环氧餐氯丙漠烷法翻：与－NH2,泰―O低H,啊―盘SH偶联偶联茫时需失强烈蛋条件例，如pH邀11，40－50亮℃，适于品特别脖稳定择的蛋商白六．籍蛋白施质含祝量的城测定爷与纯查度的齿