琼脂糖凝胶电泳

AgaroseGelElectrophoresis

琼脂糖凝胶电泳2023/7/11Aftertheexperimentisfinished,studentsshouldknowhowtomakeanagarosegel.

掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。一、实验目的(ExperimentalPurpose)2023/7/12Gelelectrophoresis2023/7/13二、实验原理(ExperimentalPrinciple)Electrophoresisisatechniqueusedtoseparateandsometimespurifyproteinsandnucleicacids,whichdifferinsize,chargeorconformationfromeachother.Electrophoresishasbecomethemostwidelyusedtechniquesinbiochemistryandmolecularbiology.电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分子构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一。2023/7/14Agaroseisapolysaccharideextractedfromseaweed.Agarosegelshavealargerangeofseparation,butrelativelylowresolvingpower.Byvaryingtheconcentrationofagarose,fragmentsofDNAfromabout200to50,000bpcanbeseparatedusingstandardelectrophoretictechniques.

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。Thehighertheagaroseconcentration,the"stiffer"thegel.HigherconcentrationsofagarosehelpintheseparationofsmallDNAs,whilelowagaroseconcentrationsallowresolutionoflargerDNAs.

2023/7/15

Agaroseistypicallyusedatconcentrationsof0.5%to2%.

ThedistanceDNAhasmigratedinthegelcanbejudgedbyvisuallymonitoringmigrationofthetrackingdyes.琼脂糖胶浓度一般在0.5％到2％之间。

通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率最大。

当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Whenadequatemigrationhasoccured,DNAfragmentscanbevisualizedbystainingwithGelview.2023/7/16琼脂糖凝胶浓度0.3%0.6%0.9%1.2%1.5%2%DNA片段分离范围6-60kb1-20kb0.5-7kb0.4-6kb0.2-3kb0.1-2kb2023/7/17Gelview

isafluorescentdye.Itisoftenincorporatedintothegelsothatstainingoccursduringelectrophoresis,butthegelcanalsobestainedafterelectrophoresisbysoakinginadilutesolutionofGelview.TovisualizeDNAorRNA,thegelisplacedonaultraviolettransilluminator.

Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色

。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。2023/7/18三、试剂与器材（Reagentsandapparatus）

1.Agarose.2.TBE[5×stocksolution(1liter):54gTrisbase,27.5gboricacid,20ml0.5MEDTA,pH8.0].3.10×loadingbuffer:0.25%bromophenolblue,40%sucroseinwater.4.Equipment:beaker,graduatedcylinder,stirbar,microwave,Panbalance,comb,electrophoresistank,andElectro-phoresisSystem,Ultraviolettransilluminator.5.Gelview2023/7/19Ⅰ.唤P词re疮pa辰ra唯ti疼on紫o良f顿t听he忙g柜el（凝太胶的庭制备革）1.制备1％琼捕脂糖猎凝胶旋。称赶取0.帝5g琼脂盏糖，疤放人鞠锥形彩瓶中缸，加壁入50棚mL的0.覆5×播TB韵E缓冲薯液，放栗入微余波炉戒加热言至完充全溶淡化，喷则为1％琼闹脂糖睁凝胶暴液。守（由于笛蒸发趁作用岁，溶催解前悲在容骆量瓶臂上作身一个乞记号白，溶助解后最用三舍蒸水瞎补足）四、丝式实验赖步骤(E筋xp情er会im衡en衫ta坟l辞Pr他oc验ed狸ur估es悲)20窜23将/6阁/2风6102.制胶吗器的某安装①取晓多功范能制脏胶器洒，洗未净，表晾干盘；②将多满功能编制胶艘器放比置于岁一水捎平位隆置，愁选择12貌×6胃cm制胶蜡架，剃然后贷选择1.趟5m房诚m倾18止te耕et限h的梳街子（庸最大榆加样喂量25µl）；③将所桃选择层规格馒的梳愚子插按入制脂胶架场的定棚位槽胶中。20少23搅/6厦/2悲6113.将熔区化的姜琼脂治糖凝他胶液么转入Ge鞭lv碌ie著w专用酒的三豆角瓶中，仗然后禾加入Ge叠lv生ie考w5µl。4.将冷死到60珠℃左右绒的琼宪脂糖沸凝胶终液，茄缓缓绩倒入码所选肚择的械制胶籍槽内锻，直炉至有塘机玻谅璃板化上形还成一躁层均冲匀的顽胶面(注意美不要吧形成区气泡)。5.待胶叨凝固累后（30嫩-6贸0m穴in），椅轻轻剃拔掉仁梳子秒，将奏凝胶剥盘从桶制胶负槽中塌取出某，放睛入电傻泳槽枝内。6.加入火电泳羞缓冲铁液(0.泳5×)至电锐泳槽殃中。20同23票/6瞎/2挺612Ⅱ.Lo蜡ad束in胁g逐DN轿A梦sa缸mp贷le楚s(加样)用移利液枪盯缓慢耻将DN分A样品租垂直践加入渔加样这孔直月至开轧口下爷方。1.DN蓝A饮sa蛙mp新le仅s：10µl2.Lo颂ad茶in答gbu痛ff垒er(6邀X)：2µl3.渠D速NA警m蔽ar英ke命rs：6µlTot洲al12弯µl20挥23纺/6田/2鞠613Ⅲ.要Ge讲l（电盈泳）1.接通非电泳恐槽与肢电泳淹仪的混电源(注意正负集极，DN议A片段川从负厘极向娱正极枕移动)。保万持电屈压60－80念V。2.当溴磁酚蓝知染料歇移动挥到距这凝胶浊前沿1-贪2c雀m处，咳停止绿电泳惭。20滋23无/6端/2柱614Ⅳ.印G钟el捉I去nt纹er霸pr卫et啊at卵io危n（凝绵胶图冠像解元释）Th追e赢un腊cu谈t挺DN萌A怀la敬ne吴m药ay戴h臂av通e适se来ve坦ra轧l族ba抽nd狮s颂in姜i宵t.悉T扰hi术s揉oc嘱cu炎rs罪b夹ec馅au仆se意t恭he愉mob竖il若it跪yof缺p晌la狱sm可id量D砍NA验i同n服anag鹊ar堤os真ege杂l驴de舅pe甲nd专s垮on公i像ts胃m垃ol毙ec池ul复ar娇c膏on闭fo紧rm返at龙io嚼n颜as池w牧el涉l局as贡i急ts宵s汤iz持e扭in技b变as遭e梯pa消ir际s.渗P暗la光sm柱id脏D趟NA碧c佛an株e禾xi底st兄i惹n肾an裹y础on宿e顺of鞠t骡hr丽ee董m锅aj锻or肿c雀on升fo兰rm肢at紫io捡ns摊:未切辟割的股质粒DN呼A在其淡泳道惭上也衫许会窜出现构几个成条带正，之杆所以中这样椅是由秆于质击粒DN祖A在琼垦脂糖欣凝胶锤中的揭迁移拥距离刘是由杜其分缎子构栗象及腐其碱努基对缝大小临所决拒定的歇。质秒粒DN买A以下乎列三所种主厨要构镜象中谈的任豪何一纹种形步式存佩在：20某23陷/6勉/2捏615Su哭pe押rc荷oi音le梯d--蜡p正la另sm处id甩i察s帐us茧ua它ll尸y兆se哲en饼a枣s秤asu佳pe庭rc护oi骨lin嗓a桥b祖ac尊te剑ri兆al刻c跪el辈l.缘瑞T岭hi宪s逗fo慎rm泰o飞f妻th雨e膛pl逗as中mi吴d贞wi漫ll落m委ov蛾e盘th径e达fa津st淋es戏t百th战ro陆ug突h游th拥e政ge逆l线du耽e袍to蒜i熊ts糠c宣om采pa烟ct紫s昆tr木uc绸tu宅re病.超螺恨旋——质粒壳在细姻菌细队胞以粥超螺坊旋结痕构存鸣在，塌由于像其结泼构致捎密，练它在观凝胶庭中的仰泳动铁速度坊最快画。20沫23旨/6菌/2狠616Ni辣ck害ed--飘Du喂ri闹ng立p撕la产sm革id生D膨NA钳r词ep随li漂ca桥ti僚on眯,to姿po句is既om师er绍-a胜seI址i坐nt亭ro温du者ce辨s松a拼ni西ck鞠i妙nt筹o谊on萝e赵st拜ra涨nd租o征f缓th届e荒DN衣A钢he慕li江x额an越d券un紫co斧il损s陆th盯e内pl跨as颗mi抄d.她P矛hy走si梦ca陈l阀sh复ea绸ri蜘ng妨a浆nd边e盆nz露ym肾at但ic降c续le禾av巨ag酷e夺du凡ri捕ng从p杰la啊sm猛id桐i组so浪la珠ti顽on拾m性ay位a座ls脚o帆in浸tr蹦od年uc你e诸ni而ck沈s泛in斧to壳t父hesu臭pe传rc府oi植le州dpl阴as赏mi便d克to诸p勿ro猛du叨ce细a滋r跨el仗ax谷ed照o叛pe命n窃ci暗rc尺ul灾ar另s恰tr屡uc型tu血re酒.切口——在质弓粒DN悦A复制施过程侨中，熊拓扑艰异构粗酶I会在DN列A双螺术旋中戴的一多条链痛中引贯入一倡个切斧口，痕解开欺质粒毯的超柳螺旋军。在垦质粒迫分离科过程苹中由尺于物桃理剪均切和精酶的筛切割愁作用飘同样珍也会拨在超弓螺旋软质粒圆中引石入切叉口从勾而产凉生松汗散的论开环恨结构育。这杠种形搅式的梦质粒恒迁移狐速率确介于惰超螺旅旋和翁线性DN秘A之间碎。20瓦23棕/6颂/2税617Li她ne帽ar——Li铅ne所arpl层as辣mi学d齐DN缘瑞A郊oc龄cu仪rs哄w徐he搬n屑da近ma史ge仓r趋es耳ul欺ts厌i蚀n壮st筒ra笋nd壮n幸ic狗ks毙d姑ir慢ec望tl瓶y挑op该po公si顷te航e然ac驴h惠ot法he饼r雪on成t祸he根D乘NA执h族el底ix选.演Th胀is磨f死or壤m哪is拖t步he肆s威lo蜓we挣st回m毫ig雕ra怖ti告ng孝f庸or居m寨of筐p糟la彩sm蠢id星.继Th幕e逗pr甜es肠en塘ce比o草f践li伯ne牵ar判D乌NA想i忍n哥a树pl坡as唤mi本d除pr炎ep联ar争at固io滩n才is嘴a屋s朽ig剂n针of夹e闻it赌he树r浙nu划cl许ea翠se学c戚on腐ta悠mi撑na慰ti合on睛o台r味sl果op请py扩l膜ab裳p言ro兄ce怪du明re知.线性——当DN虫A损伤忆在DN财A双链东相对结应的台两条蹦链上胃同时稠产生们切口奶时，砖就会败出现决线性俭质粒DN体A，这袭种DN垃A的泳促动速软率最储慢，勺质粒赞制备畜过程搜个出中现线坊性DN黑A说明稀存在偷核酸颈酶污怖染或隐实验揪操作隔有问呆题。20卡23俩/6弓/2熟618五、紫实验念结果(ex庸pe迟ri沸me妈nt驱al嚷r烧es插ul铁ts)1、DN期A相对往分子抗质量幅标准柱物（ma凡ke泼r）2、pU侦C1越9质粒DN练A经Ec至oR途I完全妄酶解3、pU矛C1携9质粒DN缠A经Ec弱oR蓝I部分座酶解4、自革提的pU箭C1锻9质粒DN榜A（此多结果阶提得糊较好迅，为1条带貌，以艳超螺卸旋为载主。胜）20路23颜/6剃/2膊619六、肠注意炼事项(No礼te队s)Th旬e腾mob坑il枪it蒜yof冬t织he时D煤NA扔d押ep急en视ds蔽o缩慧n谁th就e躬fo另ll厘ow晨in煮g求fa所ct关or荣s：Mo拘le雀cu槐la面r鼻si荐ze会o践f看DN婚ADN礼A的分士子大码小——分子裳量越糠小，旋迁移侵越快爸。b.Ag北ar武os方eco缝nc名