丝氨酸对宁南霉素生物合成的影响

丝氨酸对宁南霉素生物合成的影响【摘要】研究宁南霉素发酵过程中如何通过加入前体来提高宁南霉素的产量，进行了添加前体种类选择、前体加入量和加入时间对比实验。结果表明，丝氨酸是较佳的合成前体。添加间接前体物A和B，对宁南霉素生物合成也有明显促进作用。在发酵24、36和42h分别添加丝氨酸、前体物A和B，宁南霉素发酵效价为对照的143%、130%和141%。

【关键词】宁南霉素丝氨酸前体

Effectofserineonbiosynthesisofningnanmycin

ABSTRACTInthefermentationprocessofningnanmycin,theimprovementoftheproductionofningnanmycinbyaddingprecursorswasstudied.Parallelexperimentssuchastheselectingofprecursors,theamountandthedifferentaddingtimewereinvestigated.Resultsshowedthat,serinewasthebettersyntheticprecursor.AdditionofindirectprecursorsAandBcouldalsoobviouslypromotethebiosynthesisofningnanmycin.Serine,precursorsAandBaddedatthe24h,36hand42hinthefermentationprocess,thefermentationtiterofningnanmycinwasincreasedby43%,30%and41%thanthecontrol,respectively.

KEYWORDSNingnanmycin;Serine;Precursors

龙章富，lzf0028@宁南霉素(ningnanmycin)是中国科学院成都生物研究所、四川抗菌素工业研究所研发的一种高效、广谱、低毒、低残留、无蓄积、具有我国自主知识产权和且具有新化学结构的农用抗生素，于1997年获得中国专利权［1］。它能有效诱导植物产生酸性和碱性病情相关蛋白［2］，抑制植物病毒外壳蛋白的合成［3］，对许多植物病毒病的预防和治疗效果均高达80%［4～6］，广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、烟草、香蕉、木瓜、西瓜、番茄、辣椒、胡椒、大白菜、油菜、兰花等五个科，30多种植物病毒病的预防和治疗。销售推广到除西藏、青海以外的我国各省市以及东南亚、韩国和西班牙等海外各国，被视为目前最优良、应用最广泛的防治植物病毒病的生物农药之一。目前，世界各国的农药研发已进入优先确保对环境友好、利于人类健康为前提的新时代，因此，宁南霉素具有良好的研究和开发价值。宁南霉素对植物无药害且对植物病毒病具有很好的治疗效果，因此它具有广阔的市场前景。前期，通过对产生菌的菌种选育和发酵条件研究［7］，工业化生产发酵效价已达到15000μg/ml。但尚未涉足发酵代谢调控研究。

在抗生素发酵过程中加入前体调控代谢提高效价已有许多报道［8～12］，在红霉素、螺旋霉素、柱晶白霉素、纳他霉素、梅岭霉素的发酵过程中添加前体均明显提高了发酵效价，青霉素发酵中添加苯乙酸前体已在现代工业化生产中成功应用。宁南霉素属胞嘧啶核苷类抗生素，它的分子结构()由胞嘧啶、己糖、肌氨酸、丝氨酸等四部分组成［13］，这些组成单位既是糖氮代谢的初级产物，又是生物合成宁南霉素的前体，因此，通过添加外源性前体物，有可能使已培养好的菌体直接利用现成的添加物进行生物合成，提高发酵效价。

Molecularstructureofningnanmycin

1材料与方法

菌种

诺尔斯链霉菌西昌变种(Streptomycesnourselvar.xichangensis)，经原生质体细胞融合、P32处理和氮离子注入诱变筛选获得N12菌株，摇瓶发酵效价19884μg/ml，以下试验结果中的相对效价均以此为100%计。

培养基

斜面培养基(%)可溶性淀粉，葡萄糖，硝酸钾，花生饼粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠，碳酸钙，琼脂，灭菌前～。

种子培养基(%)玉米粉，葡萄糖，花生饼粉，酵母粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸铵，氯化钠，碳酸钙，灭菌前。

发酵培养基(%)玉米粉，葡萄糖，糊精，花生饼粉，酵母粉，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠，硫酸铵，碳酸钙，灭菌前。

培养条件

斜面培养条件28℃恒温培养10～12d。

种子瓶培养条件28℃，装量30ml/250ml三角瓶，摇瓶转速200～220r/min，培养32～34h。

发酵瓶培养条件28℃，装量30ml/250ml三角瓶，摇瓶转速200～220r/min，接种量3ml，通气振荡培养60～70h。

发酵效价检测

用微生物杯碟法测定，检定菌为腊状芽孢杆菌。

2结果与分析

发酵液中己糖和氨基酸含量

在宁南霉素发酵产素高峰末期取样，对其氨基酸种类、含量(结果见)和己糖进行分析，己糖含量为/ml，由此可见，在产素期末期，与宁南霉素化学结构组成部分代谢相关联的氨基酸仍处在较高含量水平，这为添加前体物研究提供了参考信息。

己糖种类和添加时间、添加量对宁南霉素发酵的影响

斜面培养试验表明，宁南霉素产生菌可以利用多种己糖作碳源，在预先的发酵培养基中加入等量碳源，发酵62h，以普通培养基作对照，结果如。从可以看出，与酮糖相比较，醛糖是更适宜的碳源，无论是单糖或聚糖，醛糖的发酵效价比酮糖高出近二倍。而在醛糖中，己糖的发酵效价均为聚糖的1/2，糖分析表明，在产素过程中，聚糖作碳源的己糖含量始终维持在15mg/ml左右，保证了宁南霉素生物合成的需要。

为进一步阐明己糖对宁南霉素合成的作用，在产素期间添加不同浓度的己糖，发酵65h，以普通培养基作对照，结果如。从看出，在产素的发酵时间添加适量的己糖，都不同程度地提高宁南霉素的发酵效价。从的数据还可以看出，与普通培养基相比较，在36h前添加适量的醛糖或酮糖，均能明显提高宁南霉素的发酵效价，其中醛糖提高26%，酮糖发酵效价提高23%。酮糖虽然不是发酵的理想碳源，但也可以作为宁南霉素生物合成的良好前体物。

氨基酸种类对生物合成的影响

宁南霉素是一种胞嘧啶核苷类抗生素，与其它胞嘧啶核苷类抗生素的最大差别，是宁南霉素的己糖C4位置上拥有丝氨酸肌氨酸二肽［13］，因此，向发酵培养基中添加丝肌二肽或外源性氨基酸，都有可能促进宁南霉素产生菌的生物合成。本研究分别在发酵培养基中加入丝氨酸、肌氨酸或其他A、B、C、D几种氨基酸进行发酵试验，以不加前体的普通培养基作对照，发酵65h后测定生物效价，结果如。

从看出，加入丝氨酸、肌氨酸和其他氨基酸A和B都能促进宁南霉素产生菌的生物合成，而氨基酸C和D无此作用。

氨基酸添加时间对生物合成的影响

当发酵至24、36、42、48h时，向培养基中分别加入丝氨酸和氨基酸A与B，以不添加氨基酸的培养基作对照，发酵65h后测定宁南霉素产量，结果如。从可知，在48h之前添加丝氨酸，宁南霉素产量比对照有所提高，其中在36～42h之间添加丝氨酸的效果较好，其它相关联的氨基酸A与B则不同，氨基酸A在24h加入对促进生物合成效果最好，氨基酸B加入最佳时间则在48h。两者的宁南霉素发酵效价为不添加氨基酸培养基的%和%。

氨基酸添加量对宁南霉素产量的影响

在发酵42h时分别向发酵培养基中添加不同浓度的丝氨酸和氨基酸A和B，发酵65h后杯碟法测定发酵效价，结果如。从的数据可知，加入适量的外源性氨基酸作为前体，较大程度地提高宁南霉素产生菌的合成，在14mmol/L的丝氨酸浓度下，宁南霉素的产量为对照的143%。根据丝氨酸、肌氨酸合成代谢可以预测，如果在发酵过程中采用加入其他促进丝氨酸、肌氨酸合成的化合物，可能会取得与添加丝氨酸、肌氨酸同样的效果。因此，本研究设计了添加其他氨基酸A、B、C和D。试验数据表明，氨基酸A和B也有很好的促进作用。氨基酸B添加14mmol/L浓度时发酵效价为对照的141%。

3讨论

氨基己糖胞嘧啶核苷类抗生素为一类蛋白质合成抑制剂，分子结构由己糖、胞嘧啶组成基本母核，己糖C4连接不同的侧链结构。宁南霉素拥有丝氨酸肌氨酸二肽侧链，在宁南霉素发酵过程中，向其培养液中添加宁南霉素母核的外源性前体或添加宁南霉素侧链的外源性前体物，都可能调控宁南霉素的代谢，促进宁南霉素产生菌的生物合成，而在大环内酯类抗生素生物合成中添加外源性合成内酯环前体物或其侧链前体物均能促进其生物合成便是成功的佐证。本实验在宁南霉素发酵过程中添加外源性合成基本母核的己醛糖、己酮糖或添加合成基本侧链的肌氨酸、丝氨酸，也都能促进宁南霉素生物合成。由于丝胶中含有大量丝氨酸，来源方便，因此，本文重点考察了添加丝氨酸对宁南霉素生物合成的影响。研究表明，在发酵36～42h添加14mmol/L丝氨酸，发酵产量比对照提高43%。添加与其合成代谢相关联的氨基酸A与B也能明显促进宁南霉素的合成。但由于它们与丝氨酸合成代谢所处位置不同，作用模式完全不同［14］，因此，添加氨基酸A和B的时间有很大的差异。

致谢：中国科学院成都生物研究所童佳琼同志参与大量具体工作；部分生物效价测定得到四川抗菌素工业研究所方雪萍同志的协助，在此一并表示感谢。

【参考文献】

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［3］QinSR,ZhangNH,DengGB,etal.EffectsofTMVorningnanmycintreatmentonproteincompositioninleavesandthylakoidmembranesoftobacco［J］.ChinJApplEnvironBiol(应用与环境生物学报),2004,10(2):158

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［5］HuHZ,XiangGX,ChenJR,etal.Studiesonapplicationofningnanmycintomosaicdiseasesoftobacco［J］.ChinJApplEnvironBiol(应用与环境生物学报),1998,4(4):390

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［9］WangJF,WuH.Effectofprecursorontheavermectinsbiosynthesis［J］.JSouthChinaUniv(NatSciEd)(华南理工大学学报自然科学版),2002,35(5):16

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