微生物分子生态学课件

第2章：微生物分子生态学

2.1：微生物分子生态学概念2.2：微生物分子生态学理论基础2.3：微生物对外界环境的适应和调整2.4：极端环境微生物适应性的机制及应用2.5：微生物质粒的分子生态效应2.6：微生物分子生态学研究方法2.1：微生物分子生态学概念微生物分子生态学是分子生物学实验技术应用于微生物生态学研究领域而发展形成的一门交叉学科，在分子水平上探讨微生物生态系统组成结构、功能的机理以及微生物与生物和非生物环境之间相互关系。其核心问题是研究微生物生存的环境分子生态效应和遗传分子生态效应。微生物分子生态学研究范围微生物进化不可培养微生物群落结构与多样性极端环境微生物基因转移微生物与人类健康抗生素抗药性微生物资源信号传递等。致病与免疫2.2：微生物分子生态学理论基础

（1）微生物与外界因子之间的环境和遗传分子生态效应微生物对环境以及环境中物质的耐受性和适应性是任何其它生物不可比拟的，因此探讨微生物与环境之间的分子生态效应是微生物分子生态学的根本任务。环境造就生物，生物改造和修饰环境microbe光辐射O2pH氧化/还原电位氨氮硫化氢甲烷微生物要适应和改造环境，通过改变和修饰遗传物质达到改变生理表型，逐步形成响应环境的调节系统，在适应过程中不断进化，并通过遗传将进化的结果传播下去。（2）微生物与细胞间的信息交流细胞信号传递一直是生物学研究的热点，分子生物学的发展揭示了许多动物细胞信号交流和传导途径。

长期认为微生物只能感受环境变化，微生物间没有交流，但群体感应的发现表明微生物细胞之间存在信息交流。microbemicrobe信息素microbemicrobe抗生素微生物与细胞间的信息交流，探讨的是微生物在生物细胞内环境的分子生态效应，可以进一步揭示细菌、病毒对人和动植物感染的调控作用，以及微生物次级代谢产物对其它生物的拮抗、抑制和杀灭的分子机制，探索寄生、共生、腐生等原理，为生物防治和健康医学注入新的活力。（3）分子生态病毒学分子生态病毒学是由分子生物学、分子生态学和分子病毒学融合而成的新兴分子学科。肿瘤病毒癌基因致癌特征RNA病毒的复制和致病HIVSARSHIV：人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus），是一种RNA病毒，该病毒破坏人体的免疫力，导致免疫系统失去抵抗力，从而使得各种疾病及癌症在人体内生存，并致人死亡。SARS：严重急性呼吸综合征（SevereAcuteRespiratorySyndrome），也叫传染性非典型性肺炎，SARS是一种冠状RNA病毒。MERS：

中东呼吸综合征（MiddleEastRespiratorySyndrome），MERS-CoV，一种新型冠状病毒。截止2015年5月25日，全球累计实验室确诊病例共1139例，其中431例死亡（病死率37.8%）。

（4）微生物在环境修复中的分子生态学微生物修复（bioremediation）指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。它包括自然和人为控制条件下的污染物降级或无害化的过程。

微生物群落结构及其动态变化

微生物分子多态性

微生物遗传进化2.3：微生物对外界环境的适应和调整microbe光辐射大气压pH氧化/还原电位表面水活度磁性（1）营养因子对微生物的影响微生物新陈代谢和一切生命活动赖以进行的基础。营养缺乏，导致微生物生长所需的能量、碳源、氮源、无机盐等成分不足，机体停止生长和繁殖，代谢停顿。碳源用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的来源，并为微生物的生长繁殖和代谢活动提供能源。主要功能提供微生物生长繁殖所需的能源；提供微生物合成菌体的碳成分；提供合成目的产物的碳成分。氮源氮源是指构成微生物细胞物质和代谢产物的氮素的来源。主要功能是：构成微生物细胞结构物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等；合成含氮代谢产物；作为酶的组成分或维持酶的活性；调节渗透压、PH值、氧化还原电位等；当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。无机氮源有机氮源1）氨基氮：NH4OH(NH4)2SO4NH4NO3NH4Cl2）硝态氮：NaNO3KNO31）合成产物：尿素2）天然原料：植物蛋白：黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、菜籽饼粉、麦麸、玉米浆、玉米麸质粉动物蛋白：蛋白胨、鱼粉、蚕蛹粉、牛肉膏微生物蛋白：酵母粉/浸膏、废菌丝粉其它：酒糟等无机盐和微量元素微生物在生长繁殖和代谢产物的合成过程中，还需要某些无机离子如硫、磷、镁、钙、钠、钾、

铁、铜、锌、锰、钼和钴等。各种不同的产生菌以及同一种产生菌在不同的生长阶段对这些物质的需求浓度是不相同的。无机盐及微量元素对微生物生理活性的作用与其浓度相关，一般它们在低浓度时对微生物生长和目的产物的合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用。（大量元素）（微量元素）

营养因子对微生物的影响符合Liebig定律。

Liebig定律也称最小量定律，由德国农业化学家JustusLiebig提出，认为任何生物的总产量或生物量取决于外界供给的所需养分中数量最少的那一种。遵循这一原理，我们可以有目的的促进有益微生物、抑制有害微生物的生长。遵循这一原理，我们可以有针对性的对环境样品进行富集，得到所需的功能细菌。

硝化细菌

硫细菌

污染物降解菌遵循这一原理，在污水处理过程中，碳氮比要维持在一定水平，如果保证碳氮比合适，可促进正常微生物菌群的生长，抑制球衣细菌等丝状菌的生长引起的污泥膨胀等问题。（2）光影响微生物的分子生态学光合微生物利用光能通过光合磷酸化同化CO2生成碳水化合物产生构建细胞的物质和能量。已知的光合色素有三类：叶绿素或细菌叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素。光合细菌因所含的细菌叶绿素和类胡萝卜素的量和比例不同，其菌体呈现红、橙、绿、蓝绿、紫红、紫或褐等颜色。GNSBPSBGSB阳光杆菌蓝细菌蓝细菌(Cyanobacteria)：蓝细菌曾被称为蓝藻或蓝绿藻，是一类分布很广，含有叶绿素a，能够在光合作用时释放氧气的原核微生物。蓝细菌主要以二分裂或多分裂方式进行繁殖，少数蓝细菌可形成孢子，孢子壁厚，能抵抗不良环境。PSB：细菌叶绿素a、bGSB：细菌叶绿素c、d、eP/GNSB：（3）紫外光对微生物的损伤与修复紫外辐射（200~380nm）可以杀灭微生物，尤其260nm左右的紫外波长杀灭细菌的作用是使细菌DNA分子形成嘧啶二聚体，或引起染色体的断裂、细胞分裂受到抑制、存活率下降。

实验室、食品、医院等的紫外灭菌。黑暗光复活作用UVdark（4）磁场影响微生物的分子生态效应20世纪70年代，美国微生物学家勃莱克摩在大西洋底发现了一种奇异的细菌，它们总是沿着地磁场的磁力线运动。行动时，“手拉手”排成一条条“生物磁力线”，十分整齐美观。这些就是活体“司南”，其轴向总是南北，决不会自乱阵脚。死后亦然。勃莱克摩美其名曰“趋磁细菌”。趋磁细菌具有趋磁性，是因为细菌体内含有一定数量的磁小体。磁小体在细胞内排列呈链状，是由双层膜包裹的磁铁矿（Fe3O4）或铁硫矿（Fe3S4

）晶体，约几十个纳米。趋磁细菌中铁的含量占自身重的2%~4%，是非磁细菌细胞内含量的100倍，细胞内铁浓度时培养基中铁浓度的2万~4万倍，磁小体中铁含量为84%以上。

趋磁细菌为什么要沿着地磁场方向运动呢？趋磁细菌是些厌氧性革兰氏阴性细菌，需远离水面到含氧量低的洋底进行生活，但海水的浮力很大，它们的身躯又很轻，要想生活在洋底不被漂起实属不易，经过若干亿年的进化，它们细胞中进化出了磁小体这种奇特的结构，成为磁性很强的磁体，可以随着磁场进行运动，到达最适合它们生长的环境。

磁小体特点包被磁小体的磷脂、蛋白或糖蛋白分散性极好，颗粒间不会聚集；单位体积的磁性很强。趋磁细菌及磁小体的应用前景信息存储和电子领域：理想磁性生物材料，磁小体记录材料比现在使用的磁粉粒度小、品质更均匀、磁能积提高数十倍、价格便宜，适用于制作高清晰、高保真、轻薄的大容量超高密度磁记录材料和存储器。医疗卫生领域：药物、酶、DNA、RNA等的载体，可直接运载到靶向病灶，提高对癌细胞的杀伤力和命中率；也可用于核磁共振成像的造影剂，用以检测微型肿瘤以及用于磁热疗以杀死癌细胞。生物传感器、免疫检测、废水处理、回收环境中的放射性核素污染、等。（5）温度对微生物的影响温度是生态系统中最重要的环境因子，是影响微生物生命活动的最重要因素之一。温度通过影响微生物膜的液晶结构，酶和蛋白质的合成和活性，RNA的结构和转录等，影响微生物的生命活动。耐热菌兼性嗜热菌专性嗜热菌极端嗜热菌超嗜热菌

（6）水活度对微生物的影响一切生物都离不开水，它们从环境中吸取营养物质，分解营养物产生能量及合成细胞结构和功能物质等都需要水的存在与参与。但影响微生物生长的不仅仅是水的含量，更重要的是环境中水的可利用性，即水的活度。aw=Pw/PowPw代表溶液蒸汽压力；Pow代表纯水蒸汽压力。aw纯水为1，溶液中溶质越多，aw越小。

（7）pH对微生物的影响微生物生长和代谢过程中的酶促反应都有一个最适的pH范围，在此范围内，微生物生长最快，酶活力最高。

一般细菌的最适pH范围为6.5~7.5，在pH4~10可以生长；放线菌的最适pH范围为7.5~8；酵母菌和霉菌适于在pH5~6的酸性环境下生长，但在pH1.5~10的范围都可以生长，一般真菌生长的pH范围比细菌广，细菌对环境pH范围要求相对严格。

（8）微波对微生物的影响微波是以频率介于无线电波（低于300MHz/s）和红外线（高于300000MHz/s）的电磁波，它对微生物的致死作用是微波能量产生的热效应使微生物致死。

（9）压力对微生物的影响陆地细菌在30℃和3.03×104kPa（300atm）下生长缓慢，4.04×104kPa（400atm）下生长停止；深海中的嗜压细菌在30~40℃和6.06×104kPa（600atm）下还能正常生长繁殖。有些抗压力强的微生物甚至在高于3.03×105kPa（3000atm）的环境下也不会死亡。

（10）氧化还原电位（Eh）对微生物的影响

Eh是一种物质给出电子的趋势，Eh越高其给出电子的趋势越小；由于微生物要利用环境中的各类物质给出电子时产生的能量才能生长，因此微生物所处环境的Eh对微生物的生长有显著影响。

自然环境中的Eh上限是0.816V，存在于高浓度氧而没有氧利用的环境中；Eh下限是-0.421V，存在于富含氢的系统中。

（11）其它环境因子对微生物的影响化学物质：盐类、重金属、氧化剂、有机物、表面活性剂等。2.4：极端环境微生物的适应性机制及应用在永久冻土中沉睡了3万多年之后，柳叶蝇子草的种子被科学家成功复活，现在已经开花结果。/cul/2012/03-07/3723773.shtml据英国《每日邮报》报道，在猛犸尸体的鼻粘液中发现了存活的古老细菌，这种细菌的年龄是300万年到500万年。/jykj/2009-02/13/content_450830.htm炭疽杆菌的孢子在液体空气（-190℃~-180℃）中可存活数日。肺结核菌在-10℃条件下，6周之后毒力未减。

有些分歧杆菌和葡萄球菌耐干旱能力很强，一些乳酸菌和固氮菌能耐受10年以上的干旱。有些微生物可耐受高温，东太平洋海底350℃环境下发现有细菌存在。Bacillusvermicosum能在20%NaCl和25%MgSO4溶液中生长；有的酵母菌和霉菌能在70%~80%的糖液中生活。（1）高温环境中的微生物细胞壁有G-M及短肽构成的三维网状结构呼吸链蛋白质的热稳定性高细胞膜中含高比例的长链饱和脂肪酸和具有分支链的脂肪酸，胞膜中含有甘油醚化合物tRNA中GC含量高细胞内含大量的多聚胺胞内蛋白增加分子内疏水性和分子外亲水性，共价结合许多酶类蛋白质一级结构稳定，含有钙离子的保护耐热机制淀粉酶嗜热菌产物及应用热稳定的淀粉酶和葡萄糖淀粉酶高温下有活性的异淀粉酶环糊精葡萄糖转移酶纤维素酶热稳定的纤维素酶降解木聚糖的酶热稳定木聚糖酶几丁质降解酶蛋白质降解酶DNA分子克隆工具酶DNA聚合酶反转录酶连接酶表面活性剂废物处理与甲烷生产堆肥、乙醇生产、石油开采、冶金等（2）低温环境中的微生物通过信号转导使低温微生物适应低温环境调整不饱和脂肪酸的组成和比例，维持细胞膜的流动性改变细胞膜组成、合成组成型蛋白质和酶产生冷冲击蛋白核冷适应蛋白RNA降解体的作用细胞体内糖、糖醇和氨基酸冷冻保护剂的作用形成休眠体耐冷机制酶结构的调整纺织工业用酶环境微生物修复低水活度条件下的生物催化嗜冷菌的应用洗涤剂的添加剂食品工业（3）高盐环境中的微生物Na+对维持细胞膜、细胞壁构造和功能有特别重要的作用蛋白质和酶的盐适应性嗜盐菌具有异常的膜。嗜盐菌细胞膜外有一个亚基呈六角形排列的s单层，由磺化的糖蛋白组成,由于磺酸基团的存在使s层呈负电性,因此使组成亚基的糖蛋白得到屏蔽,在高盐环境中保持稳定。H+质子泵具有排盐作用细胞内溶质浓度的调节耐盐基因耐盐机制多聚物嗜盐菌产物及应用多聚-β-羟丁酸（PHB）胞外多糖食物和食品工业食用蛋白食品添加剂酶工业酶的保护剂和稳定剂酶制剂生物电子、表面活性剂、生物化工等医药工业医用表面活性剂抗微生物物质类激素生物反应调节剂（4）碱性环境中的微生物通过呼吸作用建立质子电化学势梯度，使Na+/H+反向载体能化，催化Na+排除H+摄入，H+得以在细胞质中积累，维持细胞质pH低于其生长的环境。Na+/溶质同向载体输送溶质进入细胞Na+梯度为ATP合成提供动力产生嗜碱酶,碱性条件下在酶或蛋白质表面所形成的离子屏蔽效应,对它们的构象起稳定作用。耐碱机制（5）酸性环境中的微生物细胞表面存在大量重金属离子，可与环境中的H+进行交换，阻止H+对细胞的损伤。细胞壁和细胞膜中含有特殊化学成分（如磷、硫酯、环己烷脂肪酸、五环萜烯衍生物）含有抗酸水解的蛋白质通过膜电荷调节细胞膜电势，维持细胞内pH稳定耐酸机制脱羧酶反应煤和石油脱硫：酸热硫化叶菌酸矿水的微生物修复嗜酸菌的应用细菌冶金：氧化硫硫杆菌生产肥料：硫杆菌产生硫酸分解磷矿粉（6）高辐射环境中的微生物微生物细胞本身具有许多保护机构（色素、氧化酶、磷酸糖脂等）防止辐射对细胞的有害影响受损DNA的光复活修复和暗修复SOS修复电离辐射引起的DNA损伤超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶能有效清除细胞内的超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢。抗辐射机制修复酶制备抗辐射蛋白作为辐射防护剂抗辐射菌的应用耐辐射异常球菌对DNA损伤因子具有超强的抗性和DNA修复功能，克隆相关基因并转到入哺乳类细胞，可提高细胞的抗辐射能力。放射化疗副作用的消除2.5：微生物质粒的分子生态效应

（1）质粒定义和命名 质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母p加2-3个大写字母和数字，如pJP4，pDTG1。细菌质粒：细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子(cccDNA)，其大小在1-1700kb之间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。细菌质粒控制的性状--抗性

a.抗生素抗性细菌质粒控制的性状--抗性

a.抗生素抗性

b.重金属抗性

c.阳离子抗性

d.其它抗性细菌质粒控制的性状—结合转移

a.致育性：F因子最早在大肠杆菌中发现，以后在其他菌中也观察到，主要见于革兰氏阴性菌。在电镜下可观察到细菌间借伸长的性菌毛进行接合。细菌能否在接合中作为基因传递供体取决于致育因子（Fertilityfactor）又称F因子。这是最早发现的一种质粒。F因子编码在细菌表面产生性菌毛。F因子的特性为可以促进供体菌向受体菌传递染色体DNA或质粒。细菌质粒控制的性状—代谢能力

a.转基因Ti（tumor-inducing）质粒。Ti是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体细菌质粒控制的性状—代谢能力

b.抗生素和细菌素的产生

c.固氮：含Nit质粒的根瘤菌

d.糖、蛋白质、柠檬酸等代谢

e.色素合成

f.等。真核生物的DNA质粒：

环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性．无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。（2）质粒的生物学特性复制(Replication)

质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。不相容性(Incompatibility)在无选择压力的条件下，亲缘关系密切的不同质粒或同一不相容群的质粒不能稳定共存于同一宿主细胞，在细胞增殖过程中将有一种被排斥的现象。当一种新的质粒进入已经含有质粒的细胞中时，若两种质粒同源或近缘，它们就会竞争资源，而竞争的结果就是一个胜利另一个则被消除。但此过程需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程。不相容性(Incompatibility)质粒之间的不相容性，是由于它们存在—种或几种与质粒复制或分配有关的相同因子，如基本复制子中的反向转录区(ColE1质粒的RNAⅠ)，ori区中的重复子(Iteron)，与分配蛋白结合的分配位点。不相容性是质粒分类的理想标准。肠道细菌质粒分别属于30多个不相容组，用Inc表示。转移性(Transferability)

通过细胞与细胞之间的接触，使DNA从一个细胞转移到另外一个细胞的现象叫接合(Conjugation)。这一过程由接合性质粒的转移(tra)基因区编码。被转移的DNA可以是接合质粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性质粒。得到供体DNA的受体细胞称为接合体或接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为接合频率。接合（conjunction）

F质粒的分子大小为100kb，编码接合转移功能的tra基因区位于遗传和物理图谱的66.6－100kb位置，编码37个蛋白质和1个反义RNA，这些分子分别负责性菌毛的合成和装配，杂交对的稳定，表面排斥，DNA转移，以及tra区基因表达的调节。转化（transformation）转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。（3）质粒功能的鉴定带质粒菌株的特征自然界中同样细菌中存在有和没有某种检验的功能的两种菌株时，应怀疑可能有质粒；当检验的性状不稳定、易于丢失时；在上述观察的基础上用接合或转化的方法把所检测性状转移到另一菌株，则可能是有质粒决定的；d.假如能从结构上检测出或看到寄主染色体外的DNA，就可以探讨该种DNA的存在与否和要检测的性状的有无之间是否存在平行关系；e.检查决定所检测性状的DNA与宿主染色体不存在直接的联系。质粒的消除利用染料（吖啶橙，溴化乙锭）、抗生素（如丝裂霉素C）、表面活性剂（如SDS）、高温等方法进行人工消除。其工作机制：一是抑制质粒本身的复制和分离；二是选择性抑制带质粒细菌的生长。（4）质粒的分子生态效应质粒基因作用引起种的多样性质粒在许多菌种广泛存在，在特殊环境中携带着起重要作用的基因，从遗传学角度，质粒扩大了宿主细胞的遗传程度；从进化角度，它为种群变异提供了条件，增加了种的多样性。质粒是微生物进化的象征特殊质粒的存在使宿主细胞完善自己的生存机会，，例如，根瘤农杆菌利用Ti质粒感染植物细胞，完成互利共生的关系；通过主动适应（信号调控）和被动适应（基因转移）在特殊环境中生存。降解性质粒和环境净化的分子生态学

自然界中很多人造的化合物，例如除草剂、杀虫剂、溶剂、去污剂等，自然界的自净作用很难或需较长时间将它们分解，很多带有降解性质粒的微生物却可以快速利用和分解这些物质。

质粒的进化；

质粒转移。

2.6：微生物分子生态学研究方法微生物群落结构和多样性是微生物生态学研究的热点内容。群落结构决定了生态功能的特性和强弱。群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。群落结构变化是标记环境变化的重要方面。通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微生物功能类群提供可靠的依据。20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平低。在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的层次上。在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物，通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了关于群落结构的直观信息（1）传统的微生物研究方法Live:culturedABNC:uncultured1%BIOLOG鉴定系统在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种）利用情况。干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无色还原成紫色。每个孔中含有不同的底物菌悬液或无菌水自动化、快速仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据库还不完善醌指纹法(QuinonesProfiling)呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q)和甲基萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一步区分。每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹）的变化可表征群落结构的变化。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。磷脂脂肪酸（PLFA）、甲基脂肪酸酯（FAME）谱图分析脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析出全细胞的FAME谱图。脂肪酸谱图法分类水平较低，不能鉴定到种。另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群结构解析的可靠性。分子生物技术：在核酸、蛋白质的分子水平进行相关的核酸和蛋白质的研究。（2）基于分子生物技术的方法21世纪的开端是微生物生态学研究能力革命性进展的时期，处于这次革新前沿的是从分子生物学发展而来的研究工具。基于PCR的技术核酸分子杂交技术流式细胞技术（FCM）微阵列技术反转录PCR（rt-PCR）竞争性PCR（Q-PCR）荧光定量PCR基因指纹图谱技术扩增rDNA限制性片段分析（ARDRA）限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）单链构象多态性分析（SSCP）末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）温度梯度凝胶电泳（TGGE）扩增片断长度多态性（AFLP)随机扩增多态性DNA（RAPD)斑点印记Southern杂交和Northern杂交荧光原位杂交（FISH）宏基因组文库

1）荧光原位杂交（FISH）FISH（Fluorescenceinsituhybridization）是一门新的分子生物技术，是20世纪80年代末在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，目前这项技术已广泛应用于动植物基因组结构、染色体结构变异分析、产前诊断、基因组进化分析和环境微生物生态学研究中。FISH基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。荧光标记间接标记：用生物素或地高辛标记称为间接标记,杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号,因而步骤较多,操作麻烦,其优点是在信号较弱或较小时可经抗原抗体反应扩大。直接标记：直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记。由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信号,省去了烦琐的免疫荧光反应,不需要购买荧光抗体,也由于近