实验四农杆菌转化烟草和拟南芥

实验四、农杆菌转化烟草和拟南芥ArabidopsisthalianaNicotianatabacum选择标记基因与报告基因必备条件：编码一种不存在于正常植物细胞中的酶基因较小能在转化体中得到充分表达检测容易，并且能定量分析选择标记基因与筛选标记基因：npt-II新霉素磷酸转移酶基因（卡那，新霉素，G418），aat（链霉素，壮观霉素），spe（壮观霉素），strl（链霉素），cat（氯霉素），bar（草苷膦）报告基因：reportgene（筛选标记之一）在转化系统中通过瞬时及稳定表达检测来确定转化的DNA顺序（基因）是否能在转化细胞中得到表达，起到报告的作用。gus基因（β-葡萄糖苷酸酶基因），gfp（绿色荧光蛋白基因）转化目的基因可以省略附加的报告基因，但选择标记基因是不可缺少的。植物基因转化受体高效稳定的再生能力较高的遗传稳定性具有稳定的外植体来源对选择性抗生素敏感对农杆菌侵染有敏感性植物基因转化受体系统类型：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞受体系统植物遗传转化方法植物遗传转化农杆菌介导法基因枪法PEG诱导原生质体电穿孔法操作简单，易造成原生质体损伤双子叶植物无宿主限制，技术限制原生质体培养转基因方法农杆菌侵染法基因枪法农杆菌侵染法农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系对单子叶植物不敏感根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。T-DNA整合植物基因组的分子机理T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可插入任何一条染色体。插入位点特点：T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点T-DNA与植物DNA连接处富含A-T碱基对植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性。但在T-DNA的整合过程中常有植物基因组靶序列的缺失、倒位和重复等现象，T-DNA的整合一定程度上依赖于植物内源重组系统。总之，T-DNA的整合是通过植物靶DNA和T-DNA间短的同源区段发生重组而完成的，在接口附近伴有DNA顺序的转换和重复。真空浸透法转化拟南芥受体材料拟南芥种子消毒与萌发，播种后生长出现花蕾后打顶，待侧枝长出花蕾后，侵染前一天去除已开花蕾和果荚接种接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5mLYEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡培养过夜活化将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡过夜培养至菌液OD600为1-2诱导收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，0.015%SilwetL-77)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8转化将拟南芥花蕾倒置于装有花浸染缓冲液的烧杯中，烧杯放置在真空罐中，0.5Mbar抽真空10min培养将拟南芥植株平放在拖盘中，盖上塑料膜，避光培养。1~2d后去除塑料膜，培养至种子成熟农杆菌侵染瞬时转化烟草接种接种含有表达载体的农杆菌GV3101克隆于5mLYEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡培养过夜活化将过夜培养的菌液按照1:100的比例转接到50mL新鲜配制的YEP液体培养基(Rif100μg/mL，Kan50μg/mL)中，28°C，200rpm振荡培养至菌液OD600为1-2诱导5000rpm离心5min收集菌体，重悬于浸染缓冲液(1/2MS，5%蔗糖，乙酰丁香酮120µmol/L)，将菌液稀释至OD600为0.6-0.8侵染烟草组培苗叶片切成小块，浸泡在菌液中侵染10min后，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，置于共培养培养基（MS+5%蔗糖+乙酰丁香酮120µmol/L）上（25±2）℃暗培养条件下培养2d。注射讲法瞬堪时转什化烟茅草受体材料种植本生烟(Nicotianabenthamiana)：25°C，16h光照，约一个月后可用；在注射的前一天将烟草浇水并置于黑暗条件下；接种与活化小量培养农杆菌16-24h；按1:100转接到培养液(5mLYEP，100µM乙酰丁香酮(Aldrich)，10mMMES(pH5.6)，Rif100μg/mL，Kan50μg/mL）中，28°C16-24h诱导当菌摇到OD6001.0时，5000rpm10min收集菌体，用溶液(5ml10mMMgCl2，7.5μL100mM乙酰丁香酮)重悬农杆菌至OD6001.0，室温静置至少3h侵染用1ml注射器注射烟草叶片，避光培养约48h后，Gus染色观察乙酰吵丁香混酮Vi曾r区基圾因的避活化尺直接闸调控液着T-曾DN雨A的转羡移，阔酚类喉化合结物对Vi逮r区基业因的扫活化币具有苗重要你作用事。乙酰抓丁香渴酮（Ac啄et厦os哄yr即in茎go挠ne，分挽子式:H震OC收6H祥2(纷OC掠H3粉)2米CO液CH川3）AS：遗传隶转化堆中常见用的夫诱导睛能力管较强坡的一跪种酚叹类化纪合物陪，乙情酰丁搏香酮惧之所棒以能共够提慈高外总植体伙的转狂化频楚率，束是因云为它员可诱塔导农袖杆菌Vi逼r基因碌活化叠，从画而促依进外末源基墨因的程整合索。使用泉方法伙：在侵欲染前4-扁6h加入叶液体封培养秒基，非使农母杆菌驶既处庸于对绞数生喇长期沟，又炮处于vi句r基因讯高度节活化估状态羽，从医而提咸高侵质染能血力悬浮呆离心腊后用唐植物金外植萝体培绝养基宅稀释妨成侵登染液塞时加做入加在蜂农杆匠菌和炸外植镰体共席培养盗的培植养基军中，炸一般长农杆嘉菌附港着16丈h后才拉能进河行转昼化在农念杆菌兄液体毫培养巷基及粥共培网养基规中都演加入ASSi嗓lw袖et梢L捉-7万7拟南荣芥、油气菜等协转化驾必须月试剂绪之一振，原跌产地拾为美角国GE公司尾，Si俊lw棉et卸-L头77高效响有机悲硅表闹面活峡性剂卵，能德够极傻大的乞降低玩水的浊表面百张力(水的犁表面戒张力笼为72告.4明mN团/m，0.偶1%的Si颜lw袋et篮-L待77系列诸有机尾硅溶星液的吗表面僵张力匙约为21床mN义/m超),这使Si拜lw许et怠-L峰77有机硬硅溶凳液可照轻易厚湿润撞几乎口所有裳种类钟的叶兽面,相对侦于传图统助懂剂,显著蔽提高馆了在么靶标冬生物找的覆帆盖面.同时右，Si宣lw蛇et英-L宇77有机口硅助缴剂具柄有极周强的螺耐水电冲刷玩及渗诱透能弱力。Si珠lw袍et川-L皮77是拟床南芥尾及其导它作风物常扰用的转基唇因用麦表面趁活性辫剂。植物埋瞬时士表达民系统当外感源基锡因导推入植妨物细证胞中叼以后址，其肥表达挨方式攻有瞬田时表情达（tr暖an间si件en腰te乖xp好re装ss跑io糠n）和渣稳定禁表达拣（st堂ab裹le裳e蒜xp谊re哭ss臂io通n）两眉种。在瞬膛时表袋达状涉态的逆基因揪转移栋中，殖引入胀细胞讨的外饶源DN忧A和宿肚主细巷胞染受色体DN奖A并不喜发生计整合结。这桑些DN稀A一般悬随载欠体进舱入细秃胞后12小时亏内就之可以体表达倍，并脸持续应约80小时覆左右换。在月稳定旦表达谨状态示的基写因转虏移中宋，导悼入宿孙主细冻胞的DN跑A整合捐到细烛胞染侧色体DN渣A上，览以永扎久形各式存恳在，芳并可俘传给烂后代写，形胡成稳怎定的披转化谁细胞额。植物籍瞬时勉表达溜系统刷在启鄙动子薪分析杀、基旧因功爱能分湿析和渐生产梨重组哲蛋白先方面援用途恶广泛猪。Gu泊s基因gu屿s基因欺来源洪于E.胆co聪li染色屈体上谜的ui槽dA位点宇。编坟码β-葡萄丛糖苷馅酸酶画。β-葡萄塘糖苷弄酸酶占是一争个水丽解酶浓，以β-葡萄鸦糖苷拿酸酯梦类物逐质为伤底物众，其葵反应扑产物称可用付多种指方法舒检测琴出来浩。由火于绝蛮大多路数植贺物没绵有检指测到臣葡萄脆糖苷搂酸酶粥的背砌景活猜性，慎因此萌这个蚂基因控被广俘泛应款用于顿基因率调控率的研荐究中品。根据gu悼s基因元检测揭所用挡的底句物不哥同，田检测举方法涉有：怕组织渡化学厘法、猎分光趋光度绝法和抢荧光壶法。操作瓣要点侵染活烟草拦叶片湿无菌垂操作洲注意球事项抗生赤素的蛋正确搭使用角及抗慎生素剖敏感呈性实乒验新鲜哀的叶鸣片转凶化效搬率高侵染剖前去匆除拟南芥已挣开花碗和果坊荚侵染秀后筛娇选再亮生植药株要我注意