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文档简介
高中生物重点讲解多聚酶链式反应扩增DNA片段课件课标领航1.尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。2.理解PCR的原理和反应过程。3.讨论PCR的应用。【重点】
PCR的原理和反应过程。【难点】
PCR技术的操作过程。情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术,它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制,从而判,定疾病病原体的种类,所以从本,质上来说,这是一种分子诊断方法。基础自主梳理一、PCR扩增的原理及条件1.概念:PCR即_______________,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的_____为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2.原理(1)DNA的热变性:在80~100℃的温度范围内,DNA_________结构解体,双链分开,这个过程称为_____。当温度缓慢降低后,两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。多聚酶链式反应DNA双螺旋变性(2)子链的合成:①需要______;②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3.条件(1)______模板。(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。(3)A、T、G、C四种______________。(4)耐热的DNA聚合酶,一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备.引物DNA脱氧核苷酸pH温度思考感悟
1.什么是引物?若要克隆DNA,应加入几种特定的引物?【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时,DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3′端延伸DNA链,因此克隆DNA时应加入两种引物。二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为____、复性和延伸三步。1.变性:当温度上升到______以上时,双链DNA解聚为单链。2.复性:温度下降到_______左右,两种引物通过________________与两条单链DNA结合。3.延伸:温度上升到_____左右,溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。变性90℃50℃碱基互补配对72℃DNA聚合酶思考感悟
2.PCR循环过程中,变性温度设置95℃,时间设置30s的原因是什么?【提示】变性温度过低,解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性;在此温度条件下如果处理时间过长,将会导致酶的钝化。三、实验操作1.实验用具(1)PCR仪:该仪器能自动调控_____,实现DNA的扩增。如果没有PCR仪,可用3个___________代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管:总容积为0.5mL,实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器:用于吸取转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。温度恒温水浴锅2.操作步骤准备→____→混合→_____→反应。
四、操作提示1.为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。2.所用的_________和酶应分装成小份,并在-20℃储存。五、DNA含量的测定1.原理:利用DNA在260nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。2.计算公式:DNA含量(μg)=50×(260nm的读数)×_____________。移液离心高压灭菌缓冲液吸收稀释倍数核心要点突破要点一PCR原理1.PCR扩增方向:为了明确地表示DNA的方向,通常将DNA的羟基(—OH)末端称为3′端,而磷酸基团的末端称为5′端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,即DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。2.PCR原理——DNA的热变性原理
通过控制温度来控制双链的解聚与结合,现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。3.生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内复制PCR反应解旋在解旋酶作用下,细胞提供能量,部分解开加热至90℃以上时,双链全部解开,不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上,一条链连续合成,另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始,都是连续合成,控制温度72℃特点边解旋边复制,半保留复制体外迅速扩增TaqDNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸,且都需要在一定的缓冲溶液中进行 (2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中,正确的是(
)A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从5′端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.PCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】
__C__例1【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3′端延伸DNA链,故DNA复制需要引物,而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA,而不是氨基酸。【探规寻律】
(1)引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。(2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆,特别应注意区分PCR反应需要可变的温度,而体内DNA复制需要稳定的温度。跟踪训练(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是(
)A.加入的TaqDNA聚合酶耐高温B.不同大小DNA在电场中迁移速率不同C.此过程需要DNA连接酶D.扩增区域由两种引物来决定解析:选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的,故需要耐高温的TaqDNA聚合酶,但不需要DNA连接酶,A项正确,C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷,所以在电场中迁移速率不同,B项正确。PCR扩增需要两种引物,分别与DNA的两条模板链互补,则D项正确。要点二PCR反应的实验操作过程1.反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28~33μL1~5U/μL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA5~10μL注:①总体积50μL,②模板DNA的用量在1pg~1mg之间2.实验用具(1)PCR仪:PCR自动化程度较高,参照下表设计程序即可。循环数变性复性延伸预变性94℃,5min--30次94℃,30s
55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min若无PCR仪,可用恒温水浴锅代替,三个恒温水浴锅的温度分别为94℃、55℃和72℃,然后按照上表要求,在三个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管:一种薄壁塑料管,总容积为0.5mL。(3)微量移液器:用于定量转移PCR配方中的液体,其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。3.实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验桌上⇓用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各组分⇓盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁⇓将微量离心管放在离心机上,离心约10min⇓将离心管放入PCR仪上,设置好PCR仪的循环程序 (2011年长春高二检测)多聚酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的生化技术,反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,故DNA数以指数方式扩增,其简要过程如图所示。例2(1)某个DNA样品有1000个脱氧核苷酸,已知它的一条单链上碱基A∶G∶T∶C=1∶2∶3∶4,则经过PCR仪五次循环后,将产生________个DNA分子,其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是________个。(2)分别以不同生物的DNA样品为模板合成的各个新DNA之间存在差异,这些差异是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)由于DNA分子上的“遗传因子”基本都是符合孟德尔的遗传规律的,因此人类可以利用PCR技术合成的DNA进行亲子鉴定,其原理是:首先获取被测试者的DNA,并进行PCR扩增,取其中一样本DNA用限制性核酸内切酶切成特定的小片段,放进凝胶内,用电泳推动DNA小片段分离,再使用特别的“探针”去寻找基因。相同的基因会凝聚在一起,然后利用特别的染料在X光下,便会显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。每个人的条码一半与其母亲的条码吻合,另一半与其父亲的条码吻合。①限制性核酸内切酶能将DNA样品切成特定的小片段,这主要体现了酶的________。A.专一性 B.高效性C.多样性
D.作用条件温和②2002年6月,我国第一张18位点的“基因身份证明”在湖北武汉诞生。人的“基因身份证明”是否终身有效?________,理由是___________________________________________________________________________________。(4)请指出PCR技术与转录过程的三个不同之处:①________________________________________________________________________;②________________________________________________________________________;③________________________________________________________________________。【尝试解答】
(1)32
6200(2)碱基(脱氧核苷酸)的数目、比例和排列顺序不同(3)①A②是因为同一个体的不同生长发育阶段和不同组织的DNA是相同的,所以它有高度的个体特异性和稳定性(4)①PCR技术以DNA的两条单链为模板合成子代DNA,转录以DNA的一条单链为模板合成RNA②PCR技术的原料为脱氧核苷酸,转录的原料是核糖核苷酸③二者反应时的催化酶不同(或其他合理答案)【解析】本题考查了PCR技术的应用及相关计算与识图能力。(1)该DNA样品复制5次,产生DNA分子数为25=32个,DNA样品中T=A=200个,则样品复制5次,需要胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少为200×(25-1)=6200个。(2)不同生物的DNA样品中,脱氧核苷酸(碱基)数目、比例和排
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