测定和评估食品中所含的蛋白质及氨基酸

测定和评估食品中所含的蛋白质及氨基酸食品分析与检验技术2技能目标1．会测定食品中粗蛋白含量。2．会测定食品中氨基酸总量。3．会测定食品中不同氨基酸含量。知识目标1．明确常见的食品蛋白质含量，以及测定原理。2．明确食品氨基酸总量的含量，以及测定原理。食品分析与检验技术3项目一：测定食品中蛋白质一、案例二、选用的国家标准食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法。食品分析与检验技术4三、测定方法1．样品消化准确称取固体样品～2g,半固体样品2～5g，液体样品10～25g，使试样中含氮30～40mg（精确至），小心移入干燥洁净的100mL或500mL凯氏烧瓶中，然后依次加硫酸铜、硫酸钾6g、浓硫酸20mL、玻璃珠数粒，轻轻摇匀后，安装消化装置。将凯氏烧瓶45°斜放在电炉上，于瓶口放一漏斗，缓慢加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力，保持液面微沸至溶液呈蓝绿色透明时，继续加热～1h，取下凯氏烧瓶冷却后，缓慢加入20mL水，冷却至室温。食品分析与检验技术52．蒸馏、吸收（1）常量蒸馏：装好蒸馏装置。接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液及4～5滴甲基红-溴甲酚绿混合指示液，置于蒸馏装置的冷凝管下口，并使冷凝管下口浸入硼酸溶液中。放松夹子，沿漏斗向凯氏烧瓶中缓慢加入70～80mL40%氢氧化钠溶液，摇动凯氏瓶，至瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再从漏斗加入100mL蒸馏水，夹紧夹子。加热蒸馏，蒸馏30min(始终保持液面沸腾)，至氨全部蒸出(约250mL蒸馏液)。降低接收瓶的位置，使冷凝管口离开液面，继续蒸馏1～3min，用表面皿接几滴溜出液，以奈氏试剂检查，如无红棕色生成，表示蒸馏完毕。停止加热，用少量水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内，取下接收瓶，用的盐酸标准溶液滴定至终点；同时做空白实验，记录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。食品分析与检验技术6食品分析与检验技术7（2）微量蒸馏：安装好定氮蒸馏装置。在水蒸气发生瓶中装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，保持水呈酸性（淡红色），加热煮沸，将样品消化液转移到100mL容量瓶中并定容、摇匀。接收瓶内加入10mL4%硼酸溶液和1滴混合指示剂，置于蒸馏装置的冷凝管下口，浸入硼酸溶液中，取2～10mL稀释样液，移入反应室，并用少量蒸馏水冲洗，塞紧玻璃塞，然后向反应室加入10mL400g/L氢氧化钠溶液，立即塞紧玻璃塞，加水密封。蒸馏至硼酸吸收液中指示剂变为绿色开始计时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，冲洗冷凝管管口。取下接收瓶，用的盐酸标准溶液滴定至终点，同时做空白实验，记录空白滴定消耗盐酸标准溶液体积。食品分析与检验技术8食品分析与检验技术93．结果计算常量蒸馏按下式计算:微量蒸馏按下式计算：式中X——食品中蛋白质质量分数，%；V——滴定试样时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；V0——空白试验时消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；c——盐酸标准滴定溶液的浓度；0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol；m——试样的质量，g；F——氮换算为蛋白质的系数。食品分析与检验技术104．试剂硫酸铜CuSO4·5H2O、硫酸钾、硫酸(密度为1.8149g/L)、40g/L硼酸溶液、400g/L氢氧化钠、盐酸标准溶液、混合指示剂混合指示剂：1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L亚甲基蓝乙醇溶液，用时按2:1的比例混合；或者1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，用时按1:5的比例混合。5．实验仪器凯氏烧瓶（100mL或500mL）、可调式电炉、定氮蒸馏装置。食品分析与检验技术11四、相关知识（一）食品中蛋白质含量测定——凯氏定氮法原理将被检样品加入浓硫酸，以硫酸铜、硫酸钾为催化剂共同加热消化，食品中蛋白质分解为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，通过碱化蒸馏，使氨分离出来，用硼酸吸收形成硼酸氨后，再用盐酸标准溶液滴定，根据消耗的标准盐酸的体积，通过换算系数，可测定食品中蛋白质含量。本法摘自，适用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定。食品分析与检验技术12（二）样品消化反应过程1．样品消化、蒸馏、滴定反应过程消化反应方程式：

2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O2H2SO4+C→CO2+SO2+H2OH2SO4+2NH3→(NH4)2SO4蒸馏反应方程式：(NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O吸收与滴定：2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl→2NH4Cl+4H3BO3食品分析与检验技术132．加快食品消化反应（1）硫酸钾：硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，反应方程式为：K2SO4+H2SO4→2KHSO42KHSO4→K2SO4十SO2↑十H2O（2）硫酸铜：起催化剂作用，使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化，硫酸铜的作用机理如下所示：2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+O2↑C+CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜(褐色)生成，溶液呈现清澈的蓝绿色，故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达。食品分析与检验技术14（三）不同食品的蛋白质换算系数食品种类F 食品种类 F小麦 5.83 小麦粉及其制品 大麦、燕麦、黑麦5.83 米 花生 5.46 大豆及其制品 畜禽肉及其制品6.25 乳及乳制品 芝麻、向日葵5.4 南瓜子 栗子、胡桃5.3 其他食品食品分析与检验技术15（四）注意事项1．蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。2．为减少实验误差，所有试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。3．消化过程要不断转动凯氏烧瓶，以利于附着在瓶壁上的固体残渣洗下，促进其消化；同时为防止造成氮损失，不要用强火，应保持缓和沸腾。4．样品中含脂肪或糖较多，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫外溢，在消化开始时用小火加热，并时时摇动，也可以加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并控制热源强度。食品分析与检验技术165．一般消化至呈透明后，继续消化30min即可,有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。6．当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2～3mL后继续加热消化。7．蒸馏装置应该密封，防止漏气，蒸馏过程中不得停火断气，防止发生倒吸；消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，说明蒸馏前加碱量不足，要再增加氢氧化钠用量；蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提高液面清洗管口，再蒸馏1min而后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。9．硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中。10．混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。食品分析与检验技术17五、测定食品中蛋白质的方法（一）食品中蛋白质的意义测定食品蛋白质的含量有利于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源，同时对于提高产品质量、优化食品配方具有重要意义食品分析与检验技术18食品蛋白质测定方法测定方法利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；利用蛋白质中特定的氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。凯氏定氮法作为国家标准检测蛋白质的方法，是目前最常用的方法，是测定总有机氮最准确和操作简便的方法之一.双缩脲法，染料结合法，紫外线吸收法，酚试剂法等采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。食品分析与检验技术19(二)双缩脲法当脲被小心加热至150～160℃时，两分子间脱去一个氨分子形成双缩脲，双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜生成紫红色配合物，称为双缩脲反应，由于蛋白质分子中有肽键(—CO—NH—)，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。食品分析与检验技术201．标准曲线的绘制以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样品。按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100、110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入1mL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液(①或②)准确稀释至50mL，振摇10min，静置1h，取上层清液离心5min(2000r/min)。取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液，调节仪器零点并测定各溶液的吸光度值以蛋白质的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。食品分析与检验技术212．样品的测定准确称取样品适量(即使得蛋白质含量在40～110mg)于50mL纳氏比色管中，加1mL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度值。用测得的吸光度值在标准曲线上可查得蛋白质毫克数，由此求得蛋白质含量。食品分析与检验技术223．结果计算式中X——样品蛋白质含量，mg/100g。m——由标准曲线上查得的蛋白质含量，mg；m1——样品质量，g。4．试剂碱性硫酸铜溶液、氯化碳。5．仪器分光光度计、离心机。食品分析与检验技术236．注意事项（1）蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。（2）标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。（3）含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。（4）样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。（5）当肽链中含有脯氨酸时，若有多量糖类共存，显色不好，测定值偏低。（6）本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种籽及肉类等样品测定食品分析与检验技术24项目二：测定食品中氨基酸态氮一、案例二、选用国家标准酱油卫生标准的分析方法——甲醛值法。食品分析与检验技术25三、测定方法1．分析步骤（1）吸取酱油于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释在至刻度，吸取混匀液于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠滴定至酸度计指示pH为，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。（2）将烧杯中继续加入10.0mL36%甲醛，混匀后用氢氧化钠标准溶液继续滴定至，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。（3）做空白实验，取实验用水80mL，其余步骤同上，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。食品分析与检验技术264．结果计算式中X——食品中氨基酸态氮的含量，g/100mL；V1——测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2——试液空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V3——试样稀释液取用量，mL；c——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。5．试剂36％甲醛溶液（不含聚合物）、氢氧化钠标准滴定溶液。6．实验仪器酸度计、磁力搅拌器、10mL微量滴定管。食品分析与检验技术27四、相关知识（一）食品中氨基酸态氮含量测定——甲醛值法原理（电位滴定法）利用氨基酸含有-COOH显示酸性，又含有-NH2显示碱性的两性性质，当加入甲醛溶液时，-NH2与甲醛结合，固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，就可用氢氧化钠标准溶液滴定-COOH，以间接方法测定氨基酸的量。本法摘自GB/TT5009.39-2003《酱油卫生标准的分析方法》,适用于食品中游离氨基酸含量的测定，是国家用于粮食和其副产品豆饼、麸皮等为原料酿造或配制酱油中氨基酸态氮分析方法。（二）注意事项1．氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量。对于酱油来说该指标越高，说明酱油中的氨基酸含量越高，鲜味越好。2．固体样品要先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液，萃取在50℃水浴中进行；液体样品可以直接测定。食品分析与检验技术28五、测定食品中氨基酸态氮方法（一）食品中氨基酸态氮的意义氨基酸态氮是食品检测一项重要指标，可以作为食品分级的依据，如酱油的等级。食品中氨基酸态氮测定的方法包括甲醛值法，比色法。甲醛值法除用电位滴定法进行操作外，还可以用指示剂法进行测定，用指示剂作为反应终点。食品分析与检验技术29（二）双指示剂甲醛法指示剂分为单指示剂甲醛滴定法和双指示剂甲醛滴定法，前者分析结果稍为偏低，后者更为准确，二者实验原理同电位滴定法。1．移取含氨基酸约为20～30mg的样品2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中1份加入数滴1g/L中性红乙醇指示剂，用标准溶液滴定至琥珀色为终点；另1份加入数滴1g/L百里酚酞乙醇指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录2次所消耗的NaOH标准溶液体积（mL）。食品分析与检验技术302．结果计算式中X——氨基酸态氮的质量分数，%；c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L；V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.014——氮的毫摩尔质量，g/mmol。3．注意事项（1）此法中样品颜色较深时，可加适量活性炭脱色后再测定。（2）单指示剂甲醛滴定法，只用百里酚酞指示剂。食品分析与检验技术31（三）比色法简介在的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，氨基酸态氮与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氢化吡啶氨基衍生物，在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。食品分析与检验技术32项目三：测定食品中氨基酸一、案例二、选用的国家标准食品中氨基酸的测定——自动分析仪测定法。食品分析与检验技术33三、测定方法1．试样处理试样用匀浆机匀浆后在低温冰箱中冷冻保存，需要时解冻使用。2．称样准确称取匀浆好的试样，试样蛋白质含量在10～20mg范围。3．水解在水解管中加入6mol/L盐酸10～20mL，含水量高的试样