毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究

毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究【摘要】目的：定量研究毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌以满足临床诊断要求。方法：用毛细管区带电泳法对ATCC25922进行分离，研究其峰高与量的关系。结果：毛细管区带电泳法分离ATCC25922浓度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之间线性很好，其峰高与浓度关系符合线性方程：㏑mAU＝﹣＋×㏑C,R2＝1。结论：CZE法分离大肠埃希菌可进行定量研究。

【关键词】毛细管区带电泳；分离；大肠埃希菌

[Abstract]Objective:AquantitativestudyaboutdeterminationofEscherichiacolibycapillaryzoneelectrophoresiswastomeettheclinicdiagnosisrequest.Methods:WedeterminedATCC25922byCZEandstudiedthelinearrelationshipbetweenthepeakheight(mAU)andtheEscherichiacoliconcentration(C).Results:ThelinearrelationshipofATCC25922concentrationdeterminedbyCZEbetween105cfu/mland5×107cfu/mlwasquitegood.Regressionlineequationis㏑mAU＝﹣＋×㏑C,R2＝:EscherichiacoliATCC25922determinedbycapillaryzoneelectrophoresiscouldbeusedforaquantitativestudy.

[Keywords]Capillaryzoneelectrophoresis；Separation；Escherichiacoli大肠埃希菌是临床常见感染菌之一，由其引起的泌尿系统感染占%[1]，其诊断主要靠细菌培养法定量分析，但该法耗时较长。毛细管区带电泳是20世纪80年代发展起来的一种高效分离技术，具有快速、灵敏、低耗等优点，可用于研究多种细菌的分离。毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌ATCC25922定量研究，将有利于快速诊断，满足临床要求。

1材料和方法

仪器Beckman-CouletP/ACEMDQ毛细管电泳仪和UV检测器,河北永年锐沣色谱器件公司未涂层石英硅毛细管，上海天达pHS-3TCpH计。

试剂和菌株来源聚氧化乙烯、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司)，硼酸、氢氧化钠、盐酸，实验用水为双蒸馏水。采用上述材料配制TBE贮存缓冲液，将其1∶16稀释，添加终浓度为%的PEO(Mn600000)，并用/LNaOH和盐酸调整pH至，作为电泳缓冲液待用。ATCC25922。

方法

电泳方法采用内径75μm、有效长度为40cm的石英毛细管，阳极压力进样20s，电压25kV，电泳时间15min，25℃恒温，阴极检测，波长214nm。开机后及每一份标本检测前依次用/L氢氧化钠、双蒸馏水、电泳缓冲液20psi冲洗毛细管5min。

检测方法将血琼脂平板上经35℃，18~24h培养的ATCC25922的菌落挑于电泳缓冲液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，静置30min后进行毛细管区带电泳。

统计学方法使用SPSSforwindows软件对数据进行统计学分析。

2结果

CZE分离定量电泳图在相同条件下，应用毛细管区带电泳法分离浓度为5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大肠埃希菌,谱峰高度分别为316、61、、和mAU，峰形尖锐，分离效率高。电泳图谱见图1。

CZE分离峰高与浓度的线性关系根据5次定量试验结果，对大肠埃希菌浓度和相应检测的峰高分别取对数，以㏑C为横坐标，㏑mAU为纵坐标，作回归曲线，线性方程为：㏑mAU＝-＋×㏑C,R2＝1。

3讨论

细菌为胶体颗粒，比表面积极大，且覆盖着多糖类、肽聚糖、脂类等物质，这些化合物在电泳缓冲液中可因解离和吸附形成双电层；因而，毛细管区带电泳将细菌当作“离子”看待，以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，在电渗流作用下达到高效聚焦和分离[3，4]。毛细管区带电泳法已成功分离了多种细菌，并取得非常高的分离峰效应。我们发现大肠埃希菌ATCC25922通常保持较高的存活率，极易聚集出现杂峰，影响分离度。消除聚集可在电泳前使大肠埃希菌与运行缓冲液充分混匀后静置30min以利于缓冲液和添加剂充分与大肠埃希菌作用，形成相对稳定的单个离子减小聚集。

本研究显示毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌浓度在105～5×107cfu/ml时定量实验敏感性好、分离效率高，峰高与大肠埃希菌浓度的线性关系较好，可依据峰高用回归方程分析大肠埃希菌浓度,回归方程：㏑mAU＝-＋×㏑C,R2＝1；对于菌量105cfu/ml，本试验可将菌液进行10倍浓缩，提高浓度后检测。

随着毛细管区带电泳技术自动化操作的实现，利用其快速、高效、重复性好等优点，为临床快速、批量分离和分析微生物提供了一个很好的选择性手段。尽管毛细管区带电泳法分析微生物还存在着一些亟待解决的问题，但本研究显示经过实验条件的优化，其在微生物的分离和分析中可以得到很好的结果；毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌，操作简便、快速、灵敏度高、溶剂消耗少、环境污染小，具有较高的研究价值和前景。

【参考文献】

[1]喻华,刘华,颜英俊,等.尿路感染病原菌分布及耐药性检测[J].中华医院感染学杂志,2003，13:983.

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Armstrong,DW,GirodM,HeL,eta