2022新油菜小孢子培养及育种利用技术总结

《油菜小孢子培养及育种利用》

项目技术总结油菜育种课题组从2008年起，本课题组组织实施了嘉兴市科技计划项目“油菜小孢子培养及育种利用”（编号：2008Az2029-1）,经过4年的努力，主要开展了油菜小孢子培养体系构建，利用小孢子培养技术选育榨菜胞质甘蓝型油菜CMS恢复系并进行杂交配组研究，现在将主要技术措施和成果总结如下：油菜小孢子培养体系研究研究材料及方法项目组在查阅大量文献、并在中科院胡赞民研究组的指导下，我们进行了一系列的预备试验，确定了以下小孢子培养各个时期的培养基种类及相应配方，具体如下：小孢子游离培养基：B5-13培养基，含B5大量、微量、铁盐和有机成分，130gLi蔗糖，PH6.0；胚诱导培养基：NLN-13培养基，含NLN大量、微量、铁盐和有机成分，130gLi蔗糖，PH6.0；胚成苗培养基：含1/2MS无机盐、MS有机元素、8g・L-i琼脂、20g・L-i蔗糖、0.1mg・L-iBAP、0.1mg・L-iGA3、PH5.8；生根培养基：含i/2MS无机盐、MS有机元素、8g・L-i琼脂、20g・L-i蔗糖、0.5mg・L-iIBA、0.1mg・L-iGA3、PH5.8。为明确最佳小孢子培养体系，我们采用L9（34）正交试验设计，设基因型、低温处理时间、取材时期及花蕾花瓣花药比（代表小孢子发育时期）4个因素。根据试验设计要求于不同品种、不同生育期及不同低温处理过的花序中取符合花瓣花药比的花蕾各5个，按以下程序进行小孢培养：表面消毒后用无菌水洗3次后转移到无菌i0mL离心管，加入3mL小孢子游离培养基（B5-i3培养液），用消毒玻璃棒轻轻匀浆，经40Hm尼龙网过滤，滤液用750r/min离心5min，小心弃去上清收集小孢子，用胚诱导培养基（NLN-13培养液）重复悬浮离心游离小孢子2次进行清洗，然后加5mLNLN-13培养液于小孢子悬浮液中，加入5滴混合活性碳（活性碳溶解于NLN-13培养液中并事先进行高压灭菌），混匀后分装于5个直径6cm培养皿中，再在每个培养皿中加入2mLNLN-13培养液密封。密封培养皿置32℃培养箱中黑暗培养3天后，移至24℃黑暗条件下培养，当肉眼可见胚状体时，将培养皿转移至摇床继续培养（45r/min,24℃,黑暗）至子叶形胚期进行胚状体成胚率统计。将成熟胚转入胚成苗培养基上分化成苗,成苗小植株转入到生根培养基上培养，待生根完成后全部移栽到营养钵中假植，植株成活后进行移栽。结果与分析试验结果表明（表1），9个处理中以6号处理小孢子成胚率最高，达10.33枚/蕾，极显著高于其它各个处理，该处理基因型为51039，取样时期为植株第一朵花开放前5天，花序低温预处理2天，取花瓣花药比在0.5至1之间的花蕾进行小孢子分离培养。从正交试验方差分析显示，本试验涉及4个因素中，基因型对小孢子培养成胚率的影响最大，其次依次为小孢子发育时期，取材时期和低温预处理时间。表1、正交试验设计各处理及小孢子培养成胚率结果处理基因型低温预处理天数取材时期花瓣花药比（a）出胚率（胚/蕾）11(1209)1(0)1(-5)1(a>1)0.27efD21(1209)2(1)2(0)2(0.5<a<1)5.43bB31(1209)3(2)3(+5)3(a<0.5)1.60dC42(51039)1(0)2(0)3(a<0.5)4.93cB52(51039)2(1)3(+5)1(a>1)0.57eD62(51039)3(2)1(-5)2(0.5<a<1)10.33aA73(55028)1(0)3(+5)2(0.5<a<1)0.00fD83(55028)2(1)1(-5)3(a<0.5)0.00fD93(55028)3(2)2(0)1(a>1)0.00fD不同基因型对小孢子培养成胚率的影响本试验中，不同基因型小孢子培养成胚率存在极显著的差异，其中51039比较适合于小孢子培养，几个组合平均成胚率在3.67枚/蕾，极显著高于另两个品种组合（图1），但其处理间差异较大，其中处理6达到最高，成胚率在10.33枚/蕾，5号处理最低，成胚率只有0.57枚/蕾；组合1209成胚率次之，平均成胚率在2.33枚/蕾，其处理间差异极显著，最高5.43，最低只有0.27；组合55028成胚率最低，该基因型品种比较难进行小孢子培养，几个处理均无胚状体发生（表1）。供体条件对小孢子培养成胚率的影响供体花序的低温处理时间长短，取材时期以及供体花蕾的花瓣花药比大小对小孢子培养成胚有着极显著的作用。从图1可以看出，低温预处理可以显著提高小孢子培养的成胚率，其中低温处理2d的处理中，平均成胚率达到了3.98枚/蕾，极显著高于低温处理1d和不经低温处理的试验组合；在植株开花前及植株开花当天取材，小孢子培养成胚率极显著的高于植株开花后取材，其中植株开花前5天取材平均成胚率达3.53枚/蕾，植株开花当天取材平均成胚率在3.46枚/蕾，两者无明显差异，但均极显著高于植株开花后5天取材的0.72枚/蕾；不同的花瓣花药比在小孢子培养成胚率影响上差异极显著，其中比值在0.5至1之间的组合小孢子成胚率最高，平均达5.26枚/蕾，而以比值大于1的花蕾培养成胚率最低，平均值仅为0.27，三个水平之间差异均达到极显著水平。成胚率(胚/蕾3.98coldpretreatment■水平

level口水平2

level;色水平3level；periodofsamplingratioofpetalto1图一.正交试验各因素水平间差异Fig1.Differenceofthelevelsinthefactorsoftheorthogonaldesign结论已有研究表明基因型是决定油菜小孢子培养能否成功的主要因素，F1杂种小孢子胚产量具有明显的杂种优势表现。本试验所采用的三个基因型材料中，51039为F1杂种材料，另两个为多代自交后稳定的自交系，从试验可以看出，51039较另两种基因型具有明显的小孢子胚产量优势，基因型之间胚产量具有显著差异，基本与前人的结论符合，但由于本试验供试基因型数量有限，没有很强的说服力来验证前人的研究，有待今后进一步进行研究。国内外公认当小孢子处于单核晚期时最适合进行小孢子培养，以往的研究中花蕾取样适期大多是以花蕾长度来判断小孢子发育时期，但我们在前期试验中发现，不同的基因型材料，不同的环境条件其花蕾大小及小孢子发育时期的相关性大相径庭，有些花蕾很小但其小孢子发育时期已经处于双核期或花粉期，从而影响小孢子成胚效果，在本试验中，我们利用花瓣花药比来选择小孢子培养用的花蕾，当花瓣花药比在0.5至1之间时，取得了较好的试验效果，通过镜检发现这个时期小孢子大部分都处于单核晚期，因此我们认为通过对花蕾花瓣药比的选择，可以有效地从大田生长的油菜材料中筛选出适合于小孢子培养时期的供体花蕾材料。供体材料的生长状况及预处理对小孢子成胚率影响显著。本试验中，我们发现对花序进行低温预处理及提早取材时期可显著提高了小孢子培养的成胚率把，供体植株花蕾取样时间提前到初花前5天，并没有降低小孢子培养的成胚率，反而比开花后5天取材高，这便于育种单位有较充裕的时间进行小孢子培养，对减少小孢子培养及田间育种工作之间的时间冲突有一定的借鉴意义。通过以上试验及分析，我们得出，在嘉兴地区进行油菜小孢子培养，最适合的体系为于油菜植株初花前5天左右开始至初花前后取样，选择花瓣花药比在0.5至1之间的花蕾，以B5-13培养基为小孢子游离培养基，NLN-13培养基为小孢子胚诱导培养基，最适合诱导油菜游离小孢子成胚。小孢子胚在以1/2无机盐MS培养基为基本培养基，辅以相对应激素配比作为小孢子胚成苗及生根培养基，小孢子胚成苗率可以达到80%以上。2.利用小孢子培养选育榨菜胞质甘蓝型油菜CMS恢复系研究课题组以榨菜胞质甘蓝型油菜CMS“93-12A”及其转育不育系后代的恢复系材料“06B033”为母本，引进及自行选育材料“H40”、“中油93”、“沪油14”、“浙双72”及、“嘉0601”、“嘉0605”和“嘉0611”等为改良亲本杂交，并对其F1代材料进行小孢子培养及自然系谱选育，进行“93-12A”恢复系的改良和选育。恢复系选育方法2007年春季根据恢复性鉴定结果，确认“06B033”为“93-12A”的恢复材料，即以其为母本，与恢复系改良亲本进行杂交获得可代种子，2007年下半年进行直播，2008年春以这些配组F1为材料进行小孢子培养获得DH0群体，2008年秋对DH0群体进行田间移栽定植，2009年春进行分单株套代自交，并将其与“93-12A”及其转育后代不育系“0801A”、“0802A”、“0804A”、“0812A”进行配组，2010年春鉴定配组后代育性。结果与分析不同组合小孢子培养效果根据试验设计,不同组合的小孢子培养结果如表2。由表中可见，以恢复系“06B033”为母本，7个不同自交系为父本配制的组合中，小孢子培养的效果差异显著，特别是在出胚率方面，表现出极显著的差异。7个组合中，以“06B033X沪油14”组合小孢子培养效果最好，出胚率达到平均63.33胚/蕾，极显著高于其他各个组合，以“06B033X中油93”组合次之，出胚率为23.67胚/蕾，显著高于其他各组合；而以“06B033xH40”和“06B033xH40”两个组合效果最差，两个组合3个培养皿中均只发现一个胚，并且发育并不完全，不能成苗。从试验结果看，基因型对小孢子培养的成胚率起着决定性的作用。不同组合小孢子胚成苗率及自然双倍化比较表2不同组合小孢子培养效果组合名称出胚率（胚/蕾）胚总数成苗数成苗率双倍体苗数双倍体苗率06B033XH400.33e*D100.000/06B033义中油9323.67bB716388.732336.5106B033X沪油1463.33aA19012867.375845.3106B033义浙双7210.33cdCD312580.65520.0006B033X嘉06013.67deD11881.82112.5006B033X嘉06050.33eD100.000/06B033X嘉061114.00cBC423788.10821.62*同列数值后含相同的小写或大写字母表示在0.05或0.01水平差异不显著。从表2可见，不同组合小孢子培养在出胚率存在显著差异，但在成苗率的比较上差异较小，除“06B033xH40”和“06B033X嘉0605”出胚率太小，无有效成苗外，其余组合成苗率基本都能在80%以上，而“06B033X沪油14”由于单皿成胚数平均达到63.33枚，从而导致培养基在营养供给上可能存在不足，成苗率相对较低一些，但也达到了67.37%，但其小孢子培养有效成苗数仍明显高于其他各个组合。同时，由表可见，油菜小孢子培养自然双倍体率较高，从本研究试验的7个组合中，自然双倍体率在12.5%〜45.31%之间，其中“06B033x沪油14”和“06B033X中油93”两个出胚率和成苗数较多的组合自然双倍体率分别达到%和36.51%，双倍体苗数分别有58株和23株，为后续进行恢复系的选育提供了较好的基础。小孢子培养双单倍体的恢保系鉴定对“06B033x沪油14”和“06B033x中油93”两组合的小孢子培养后代双单倍体单株进行套袋自交，并以其为父本与,93-12A”转育后代不育系0801A、0802A、0804A、0812A进行配组，鉴定其后代育性情况。通过鉴定，我们选取后代群体较大的组合进行重新编号，并将鉴定结果列表。从表3、表4可见，两个组合的DH1群体中，对不同单株的鉴定结果显示，单株之间对榨菜胞质CMS的恢保关系存在着差异，其中“06B033X沪油14”组合中的2、3、4、5、10、16、19号单株，“06B033X中油93”组合中的4、5、11号单株对4个榨菜胞质不育系材料均表现出较好的恢复性，“06B033X沪油14”组合中的7、12、18、20号单株和“06B033X中油93”组合中的1、6、7号单株对4个榨菜胞质不育系均表现出较好保持性，而其余单株则对4个榨菜胞质不育株系的育性部分保持或恢复，部分配组后代则出现不规则的育性分离。表3“06B033义沪油14”DH群体的单株恢保性鉴定不育系1234567891011121314151617181920210801AF*RRRRFAFFRRARFFRRARAR0802AARFRRFARRRAAFFFRRARAR0804AARRRRFARRRAAFFARRARAR0812AARRRRFARRRFARFARRARAF*F、A、R分别表示配组后代育性分离、完全不育、完全可育，下同。表4“06B033义中油93”DH群体的单株恢保性鉴定不育系1 23 4 5 6 7 8 9 10 11 120801AA RRRRAAFRRRF0802AA FR R R A A F R R RR0804AA RR R R A A F R F RA0812AA FFRRAAFFRRA小孢子培养双单倍体恢复系的初步杂交配组根据恢复性鉴定结果及植株田间农艺性状表现，初步选定“06B033X沪油14”组合的DH0-1-2，DH0-1-5，DH0-1-16，DH0-1-19及“06B033x中油93”组合的DH0-2-11这5个双单倍体单株自交系为榨菜胞质CMS恢复材料，并以其DH1代群体为恢复系，3份优质榨菜胞质CMS“0914A”、“0915A”和“0916A”为母本进行杂交配组，共配制15个组合，通过花期田间不育株率调查，发现5份材料对3份榨菜胞质不育系均具有较好的恢复育性作用，其中绝大部分组合不育株率均为0（表5），部分不育株率都在5%以下，只有两个组合不育株率在5%以上，从育性恢复角度，均能达到杂交种生产上的要求，因此，我们认为这5份材料是榨菜胞质甘蓝型油菜CMS稳定的恢复系。表4不同DH株系配制杂交组合的育性鉴定母本 0914A 0915A 0916A父本DH1DH1 DH1DH1DH1DH1 DH1 DH1DH1 DH1 DH1 DH1DH1 DH1 DH1-1-2-1-5 -1-16-1-19-2-11-1-2 -1-5 -1-16-1-19 -2-11 -1-2 -1-5-1-16 -1-19 -2-11不育株率1.4 0 0 0 0 2.8 4.2 1.4 0 0 2.8 0 8.3 1.4 6.9（%）2.3结论利用小孢子培养技术进行单双倍体育种可以大大加速育种进程已在国内外获得了广泛的共识，目前在一些性状的选育上已得到较好的证明，如甘蓝型黄籽性状的纯合、选育PolTCMS不育两用系等，但如何通过更加优化的小孢子培养技术来提高目标