血液分子生物学癌干细胞和造血干细胞

◆恶性肿瘤具有无限增殖和侵袭性生长的特点，传统的观念认为肿瘤形成是所有肿瘤细胞共同增殖的结果。◆然而，在白血病的研究中发现，白血病的形成和发展与正常造血系统有极大的相似之处（1997年JohnDick等定义了第一个肿瘤干细胞，急性髓细胞性白血病（AML)的白血病干细胞），由此提出了肿瘤形成的新模式——癌干细胞学说。为肿瘤发生机制的认识提供了一条新思路本文档共46页；当前第1页；编辑于星期一\20点45分

癌干细胞——在肿瘤中的一小部分具有无限增殖能力，并形成肿瘤能力的细胞，也称肿瘤干细胞。癌干细胞

癌干细胞在癌组织中所占的比例很少，具有形成能力是癌干细胞的本质特征。目前已经在乳腺癌，脑瘤等实体瘤以及血液系统肿瘤中发现了癌干细胞。鉴定癌干细胞的方法通常是首先通过分子标志将肿瘤细胞悬液用流式细胞仪分选为若干亚群，然后将不同的细胞亚群移植到裸鼠的体内观察其成瘤性，癌干细胞就存在于具有成瘤性的细胞亚群中。本文档共46页；当前第2页；编辑于星期一\20点45分

癌干细胞的特点自我更新性

是指一个细胞分裂为两个细胞，但其中一个子代细胞仍然保持与亲代细胞完全相同的未分化状态；而另一个细胞则定向分化，这种分裂称为不对称分裂。癌干细胞通过自我更新维持着肿瘤的持续生长。癌干细胞积累了所在肿瘤的基因突变，正是这些基因突变导致了肿瘤细胞的过度增殖，乃至转移播散。.本文档共46页；当前第3页；编辑于星期一\20点45分本文档共46页；当前第4页；编辑于星期一\20点45分

2.高致瘤性

癌干细胞的致瘤性因肿瘤种类不同差别较大，主要从两个方面进行评价：一是癌干细胞在体外克隆形成的能力;二是癌干细胞在免疫缺陷细胞动物体内的肿瘤形成。本文档共46页；当前第5页；编辑于星期一\20点45分

3.分化潜能具有多向分化潜能，能够重建相应组织所有的细胞成分。肿瘤干细胞能够形成缺乏自我更新能力但具有分裂能力的子代细胞。肿瘤不能分化正常的成熟细胞，但能发生不同程度的有限的分化，从而形成组织病变学各异的肿瘤。本文档共46页；当前第6页；编辑于星期一\20点45分4.耐药性

癌干细胞表达多种抗药性蛋白，对许多化疗药物具有抗性，是导致肿瘤化疗失败的主要原因。失败本文档共46页；当前第7页；编辑于星期一\20点45分癌干细胞与干细胞的共性与区别共性1.都具有自我更新和增殖能力，但肿瘤干细胞不受正常机体内环境的调控；2.都具有不同的表型和异质性干细胞表面的特殊表型用于调控自身增殖和周围细胞分化的功能；癌干细胞亚型不同，其生长分化能力、侵袭能力和耐药性也不同。本文档共46页；当前第8页；编辑于星期一\20点45分3.

相似的生长调节机制和信号转导通路，都具有端粒酶活性，在正常干细胞的恶性转化实验中发现，端粒酶活性和基因突变是正常干细胞恶性转化的两个必要条件。4.都具有多分化潜能,Gao等研究发现，CSC具有比肿瘤细胞更强的产生血管生成因子的能力，可促进形成血管。提出CSC可能是导致抗肿瘤血管生成治疗困难的一个原因。5.

有相似的表面标志物，如造血干细胞和白血病细胞都表达CD34和CD90本文档共46页；当前第9页；编辑于星期一\20点45分CSC与干细胞区别：①CSC的自我更新信号转导途径的负反馈机制已破坏。②缺乏分化成熟能力。

③倾向于累积复制的错误，而干细胞能够防止复制错误的发展等。本文档共46页；当前第10页；编辑于星期一\20点45分新治疗策略本文档共46页；当前第11页；编辑于星期一\20点45分治疗思路1.削弱增殖能力2.促进分化3.破坏微环境4.诱导凋亡5.增加对放疗和化疗的敏感性本文档共46页；当前第12页；编辑于星期一\20点45分抑制癌干细胞信号通路和相关酶的活性，削弱增殖能力。本文档共46页；当前第13页；编辑于星期一\20点45分诱导癌干细胞分化，消耗其分裂潜能，达到抑制肿瘤发展的目的。本文档共46页；当前第14页；编辑于星期一\20点45分破坏为癌干细胞提供养分和保护的微环境，抑制增殖和成瘤的能力。本文档共46页；当前第15页；编辑于星期一\20点45分用靶向性病毒载体携带促凋亡基因诱导癌干细胞进入凋亡程序，达到清除目的。本文档共46页；当前第16页；编辑于星期一\20点45分抑制抗性相关蛋白的表达，增加对放疗和化疗的敏感性，提高放化疗的有效率。本文档共46页；当前第17页；编辑于星期一\20点45分癌干细胞的来源？癌干细胞是正常的成体干细胞甚至体细胞基因突变所致？

癌干细胞主要来源于细胞融合。

癌干细胞起源与病毒有关。

癌干细胞起源于残留的静止的胚胎干细胞。

尚未解决的科学问题本文档共46页；当前第18页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞

一、造血干细胞的起源*造血干细胞（hemopoieticstemcell,HSC）是存在于造血组织和血液中的一群原始造血细胞，它不是组织固定细胞.*造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊.*第4周开始转移至胚肝.*妊娠5个月后，骨髓开始造血.*出生后骨髓成为干细胞的主要来源.*在造血组织中，所占比例甚少，如在小鼠骨髓中105细胞中有10个，在脾中105细胞中只有0.2个.本文档共46页；当前第19页；编辑于星期一\20点45分二、造血干细胞的形态干细胞是一种嗜碱性独核细胞，其大小约为8μm，呈圆形，胞核为圆形或肾形，胞核较大，具有2个核仁，染色质细而分散，胞浆呈浅蓝色不带颗粒，在形态上与小淋巴细胞极其相似，很难用形态学识别干细胞，较难与其它细胞相区别。造血干细胞可包括三级分化水平，即多能干细胞（pleuripotentstemcell），定向干细胞（Committedstemcell）及其成熟的子代细胞。

本文档共46页；当前第20页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞生物学特征自我更新能力

多向分化能力静止性不均一性（异质性）

本文档共46页；当前第21页；编辑于星期一\20点45分

■造血干细胞的表面标志造血组织中造血干细胞的比例极低,数量极少且形态上无法与其他细胞相区别,故对造血干细胞表面标记的认识,有助于造血干细胞的分离、纯化和研究。

近年来由于单克隆抗体技术的进步，流式细胞仪（FACS）的应用，以及对小鼠和人造血干细胞表面标志的研究，取得了很大进展，为造血细胞的分离纯化及鉴定创造了条件。本文档共46页；当前第22页；编辑于星期一\20点45分CD34+*是原始造血干细胞的一种重要标志。*CD34+细胞群,在体外与造血因子共同培养,可获得含各类血细胞的混合集落,由此证明骨髓中CD34+细胞为原始造血干细胞。*CD34+细胞占骨髓细胞的1%-4%。*在脐血,CD34+细胞占0.01%-0.09%。*随着造血干细胞分化成熟,其表面CD34表达水平逐渐下降,成熟血细胞不表达CD34。

本文档共46页；当前第23页；编辑于星期一\20点45分单克隆CD34-细胞可重建所有的造血细胞系。CD34+细胞和CD34-细胞之间的关系为,二者可相互转换,形成“干细胞循环”。IL-6可促进CD34-细胞增殖,还能使CD34+细胞逆转为CD34-细胞,而SCF又可使CD34-细胞转化为CD34+细胞。

此两类细胞均可存在于骨髓或外周血中。目前认为,最早期的HSC可能是CD34-细胞,其分化为CD34+HSC细胞,然后分化为造血祖细胞。

x本文档共46页；当前第24页；编辑于星期一\20点45分CD34+细胞选择法亲和柱层析，分离和免疫磁珠法。通过特异性识别、俘获及洗脱分离得到CD34+细胞。（1）亲和柱层析:将预分选的细胞与生物素化（biotinglated）的抗CD34抗原的单抗一起孵育，然后洗去未结合的抗体，通过抗生物素蛋白包被的聚丙酰胺柱的亲和柱，使CD34+细胞留滞在柱内的聚丙酰胺表面上，再经机械摇动，冲洗出CD34+细胞。

本文档共46页；当前第25页；编辑于星期一\20点45分（2）免疫磁珠分离法：CD34单抗标记细胞后，与超顺磁性微球连接、通过强磁场中的过滤柱时，阳性细胞被吸附，阴性细胞被滤掉。已研制出了纳米微粒作为固相收集CD34+细胞。通过将采集物与抗CD34抗原的单抗结合，细胞特异地被超顺磁铁－葡聚糖纳米（直径50nm）微球结合，使CD34+细胞与纳米微球形成复合物，再通过磁铁诱导的强磁场过滤柱，分离出CD34+细胞。其CD34+细胞回收纯度＞95％。本文档共46页；当前第26页；编辑于星期一\20点45分CD117+（Kit）干细胞生长因子受体（SCFR）。CD117+细胞占骨髓的1%-4%。50%-70%的CD117+骨髓细胞表达CD34。SCF通过与CD117结合发挥促进HSC增殖分化的作用。在最早期的造血细胞表面,CD117密度较低。随着分化发育而密度逐渐增加,至祖细胞阶段CD117密度达最高。随着向终未成熟血细胞分化,CD117表达又逐渐下降。

本文档共46页；当前第27页；编辑于星期一\20点45分CD38:也是干细胞的分化标志之一。CD34+细胞可分为CD34+CD38-和CD34+CD38+两个亚群,前者更为原始。CD38的表达可用于判断HSC的分化程度，也可用于分离HSC。Thy-1＋(low)。其他谱系特征型标志:HSC不表达CD3、CD4、CD14、CD16……、CD19、CD41等表面标志，属于谱系阴性（Lin-）细胞，据此可鉴别和分离HSC。本文档共46页；当前第28页；编辑于星期一\20点45分脐血来源干细胞的特点HSC主要来源于骨髓、成人外周血、脐血。脐血有如下特点：造血干细胞含量丰富，虽然CD34＋细胞数低于骨髓，但CD34＋CD38-细胞数高于骨髓，且脐血CD34＋CD38-细胞增殖分化能力高于骨髓，尤其是加入各种细胞因子后CFU-GEMM、BFU-E集落数明显高于骨髓。淋巴系统抗原表达弱，淋巴细胞功能不成熟，这显示出脐血干细胞移植(UCBT)后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率可能较低。研究表明冻存10年的脐血HSC仍具有良好的回收率。本文档共46页；当前第29页；编辑于星期一\20点45分骨髓干细胞

造血干细胞

骨髓基质干细胞

多能前体细胞

骨髓基质干细胞：缺乏特异的表面标记物,目前报告的基质干细胞的表面抗原有Stro1,CD13,CD49,CD29,CD44,CD71,CD90,CD106和CD124.由于缺乏特异的表面标记物,在不同的实验室有不同的技术对其进行分离.获得的细胞功能一致性有待研究,因此对其多能性有不同的发现,如一些报告认为基质干细胞在体外能分化为神经细胞,而有的试验则认为不能分化为神经细胞.

本文档共46页；当前第30页；编辑于星期一\20点45分骨髓干细胞

造血干细胞

骨髓基质干细胞

多能前体细胞

多能前体细胞：多能前体细胞能够在小鼠、大鼠及人的骨髓或其他组织细胞培养中获得.和骨髓基质干细胞一样,它在体外贴壁生长,但是和基质干细胞不同的是,多能前体细胞在体外在相对差的营养条件下无限期地生长。在体外,特异性的生长因子能够诱导多能前体细胞分化为外中内各胚层细胞,在体内,多能前体细胞也显示了其广泛的分化潜能.

本文档共46页；当前第31页；编辑于星期一\20点45分骨髓干细胞的可塑性

造血干细胞不仅能重建造血细胞,而且能分化心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、消化道上皮细胞、肺上皮细胞等。骨髓基质干细胞在恰当的刺激下能转化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、星形细胞、神经细胞、心肌细胞等。骨髓多能前体细胞,其表达胚胎干细胞的遗传标志,体外培养条件类似于胚胎干细胞,且能高度扩增。在体外它不仅能分化成基质细胞,而且能分化为内脏中胚层、神经外胚层细胞和肝细胞等内胚层细胞。

本文档共46页；当前第32页；编辑于星期一\20点45分骨髓干细胞可塑性机制

局部环境有关:①对造血系统被破坏的小鼠进行肌细胞移植后,小鼠造血功能恢复,是由于肌肉组织内的造血干细胞的作用引起。②肝损害的小鼠进行骨髓移植后,肝脏再生的原因是骨髓中的卵圆细胞在肝内转化为肝细胞。成体许多组织内余存一种稀有数量的原始干细胞,其类似于胚胎干细胞,始终保持着胚胎干细胞的特性,在不同的条件刺激下能分化为内胚层、中胚层、外胚层多种组织细胞.本文档共46页；当前第33页；编辑于星期一\20点45分骨髓干细胞可塑性机制干细胞可以经历转分化的过程,细胞的基因信息可以重组,经过基因重组,细胞能够转化为多种不同的细胞。如从视网膜中提取少突胶质细胞,在体外无血清,低密度的培养条件下,获得神经干细胞的功能和特征。细胞融合是最近对干细胞可塑性的又一种解释。如将小鼠骨髓干细胞和胚胎干细胞,或小鼠神经干细胞和胚胎干细胞共培养后,获得的融合细胞表现胚胎干细胞的功能和特征.

本文档共46页；当前第34页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植概况

自1993年以来，自体外周血干细胞移植（autologousperipheralbloodstemcelltransplantation;APBSCT）的数量超过了自体骨髓移植（ABMT）。近几年，随着对脐血研究的不断深入，发现人类脐血中含有大量的造血干/祖细胞，其中淋巴细胞抗原性弱，功能相对不成熟，移植后发生急性移植物抗宿主病（GVHD）的危险性低等，已成为造血干细胞移植的又一方法，即脐血干细胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。本文档共46页；当前第35页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点

一、移植种类（一）根据造血干细胞来源分类

1、骨髓移植（bonemarrowtransplantation,BMT）.

2、外周血干细胞（peripheralbloodstemcelltransplantation,PBSCT）。

3、脐血干细胞移植（cordbloodstemcelltransplantation,CBSCT）。（二）根据供者来源不同分类

1、同基因造血干细胞移植（syngeneicHSCT,syn–HSCT）。

2、异基因造血干细胞移植（allogeneicHSCT,allo–HSCT）。

3、自体造血干细胞移植（autologousHSCT,AHSCT）.

本文档共46页；当前第36页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点（三）二者结合分类

1、同基因骨髓移植（Syn–BMT）

2、同基因外周血干细胞移植（Syn–PBSCT）

3、异基因骨髓移植（allo–BMT）

4、异基因外周血干细胞移植（allo–PBSCT）

5、自体骨髓移植（ABMT）

6、自体外周血干细胞移植（APBSCT）

7、脐血干细胞移植（CBSCT）（四）根据预处理强度分

1、清髓性异基因造血干细胞移植

2、非清髓性异基因造血干细胞移植

本文档共46页；当前第37页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点二、各类造血干细胞移植特点（一）同基因造血干细胞移植

1、供者为同卵孪生同胞，不存在HLA（humanleukocyteantigen）差异。

2、易于植入，不存在排斥及移植物抗宿主病（GVHD），亦无移植物抗白血病效应（GVL）。

3、不需进行移植细胞的体外净化。

4、移植并发症较少，安全性高，移植费用较低。

5、移植后恶性疾病复发率较异基因造血干细胞移植为高。

6、移植适应症较广泛。

本文档共46页；当前第38页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点（二）异基因造血干细胞移植

1、需要有HLA相同的同胞或非血缘关系志愿者作为供者，理论上同胞兄妹间有1/4的机会相配，非同胞兄妹间约1/10万-1/20万。

2、供受者之间存在不同程度的免疫学差异，移植后可发生排斥反应及移植抗宿主反应GVHD。

3、供者干细胞为正常细胞，移植适应症广泛。

本文档共46页；当前第39页；编辑于星期一\20点45分4、移植物中无残留病变细胞，不需体外净化，移植后有抗白血病效应，因而移植疗效确切，肿瘤性疾病的复发率低，效果最好。

5、移植相关并发症、死亡率较高，移植费用较高。

6、移植成活后，因GVHD的影响，生存质量较自体移植差。

本文档共46页；当前第40页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点（三）自体造血干细胞移植AHSCT

1、供者为患者本人，不受供髓来源限制。

2、是否适宜进行AHSCT，受患者自身病情限制，移植适应症较窄。

3、因移植物中可能有残留病变细胞，移植后病情复发率较高。

4、需考虑进行体外净化处理移植物，以改善疗效。

5、移植相关并发症、相关死亡率较低，适宜移植患者的年龄范围较大，移植费用较低。

6、无GVHD，移植成功后生存质量较好。本文档共46页；当前第41页；编辑于星期一\20点45分造血干细胞移植种类及特点（四）外周血干细胞移植

1、外周血中造血干细胞收集比较方便，用血细胞分离机进行分离、采集，采集方法可重复，供体无需麻醉，可免于多部位骨髓穿刺的痛苦和不便，供者易于接受。

2、因从外周血进行造血干细胞的采集，对骨髓有浸润纤维化或接受过骨盆放疗的患者仍可施行。

3、正常情况下外周血干细胞含量很少，需进行动员处理方可有效增加外周血干细胞含量，以供移植时采集。

本文档共46页；当前第42页；编辑于星期一\20点45分

4、与