细胞培养基本知识基本技术

主要内容：1、细胞培养基本知识2、培养细胞生长的条件3、细胞培养的基本技术本文档共63页；当前第1页；编辑于星期二\5点21分一、

细胞培养把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。本文档共63页；当前第2页；编辑于星期二\5点21分培养细胞的特性1-生长方式及类型贴附型、悬浮型本文档共63页；当前第3页；编辑于星期二\5点21分培养细胞的特性2-增殖特点体外培养的细胞既保持了一定的体内细胞的基本特性，但也具有本身的一些特点。贴附-伸展接触抑制-增殖的密度抑制本文档共63页；当前第4页；编辑于星期二\5点21分贴附-伸展本文档共63页；当前第5页；编辑于星期二\5点21分接触抑制当一个细胞被其他细胞围绕导致无处可去而保持接触时，细胞不再移动，在接触区域的细胞膜活动将停止。因此，一般正常细胞并不相互重叠于其上生长。本文档共63页；当前第6页；编辑于星期二\5点21分细胞增殖密度抑制当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在静止状态下维持存活一段时间，但不会继续分裂生殖。转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以增殖至较高的终末细胞密度。本文档共63页；当前第7页；编辑于星期二\5点21分培养细胞的特性3-生长过程单个细胞增殖：细胞周期本文档共63页；当前第8页；编辑于星期二\5点21分高等生物体，细胞周期时间的长短变化主要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h本文档共63页；当前第9页；编辑于星期二\5点21分一群细胞的增殖：细胞生长曲线接种后，每天进行检测计数，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。本文档共63页；当前第10页；编辑于星期二\5点21分潜伏期/滞留期指数增长期平台期/停滞期退化或死亡本文档共63页；当前第11页；编辑于星期二\5点21分细胞系的生长过程细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系本文档共63页；当前第12页；编辑于星期二\5点21分有限细胞系：如果不能继续传代或传代有限，可称为有限细胞系。连续细胞系：能够连续传代的细胞叫做“连续细胞系或无限细胞系。可培养50代以上并无限培养下去。大多数的二倍体细胞为有限细胞系。无限细胞系大多已发生变异。本文档共63页；当前第13页；编辑于星期二\5点21分原代细胞：从机体取得组织材料，在体外培养生长，到第一次传代前。传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。本文档共63页；当前第14页；编辑于星期二\5点21分培养瓶培养法方法：将培养对象直接接种于培养瓶内，再放入培养箱进行培养。优点：1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响。2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作，以及永久保存。3、增加了培养瓶的培养面积。本文档共63页；当前第15页；编辑于星期二\5点21分培养板培养法方法：将培养细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱内培养。应培养量较小也称为微量培养。本文档共63页；当前第16页；编辑于星期二\5点21分悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早建立的体外培养技术基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中培养。本文档共63页；当前第17页；编辑于星期二\5点21分1907年-Harrison用细胞培养解决一个难题盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法本文档共63页；当前第18页；编辑于星期二\5点21分悬滴培养法基本步骤1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向下压向盖玻片3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。放入培养箱培养本文档共63页；当前第19页；编辑于星期二\5点21分1910至1923年–Carrel和早期的组织培养卡氏瓶培养法本文档共63页；当前第20页；编辑于星期二\5点21分1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。本文档共63页；当前第21页；编辑于星期二\5点21分无血清培养无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。往往针对性很强，价格偏高。本文档共63页；当前第22页；编辑于星期二\5点21分三维细胞培养技术

将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。本文档共63页；当前第23页；编辑于星期二\5点21分普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化,难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。应用：软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨）循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）本文档共63页；当前第24页；编辑于星期二\5点21分目前常用的三维培养模型：基质覆盖培养旋转烧瓶培养微载体培养预置支架培养旋转细胞培养系统自发性细胞聚集本文档共63页；当前第25页；编辑于星期二\5点21分细胞培养技术的特点及应用优点：1）研究的条件可以人为控制2）研究的样本均一3）研究内容方便观察、检测、记录4）研究的费用相对于经济缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体内的细胞。本文档共63页；当前第26页；编辑于星期二\5点21分应用病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产……免疫学：杂交瘤-单克隆抗体……遗传学：染色体分析……肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物……分化及发育：刺激使细胞群体发生改变……细胞毒实验：药效测试……临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……本文档共63页；当前第27页；编辑于星期二\5点21分营养需要环境要求无毒及无污染二、培养细胞生长的条件本文档共63页；当前第28页；编辑于星期二\5点21分1、细胞的营养需求（1）氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子（2）促生长因子等完全培养基的组成：基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100单位／毫升本文档共63页；当前第29页；编辑于星期二\5点21分基础培养基的选择参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、DMEM-F12等……本文档共63页；当前第30页；编辑于星期二\5点21分血清热灭活：56℃,30分钟加热已完全解冻的血清(目前少用）热灭活目的：灭活血清中的补体成分。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。

热处理造成血清沉淀物增多，影响血清质量。甚至严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。血清中的沉淀物絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5分钟去除，也可不用处理显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清本文档共63页；当前第31页；编辑于星期二\5点21分血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。本文档共63页；当前第32页；编辑于星期二\5点21分pH调整液NaHCO3溶液（碱）常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4℃保存HEPES（分子量238.31）溶液一种弱酸，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性主要作用:防止培养基pH迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES使用终浓度一般为10-50mmol/L常配成1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4℃保存。使用时可向100ml培养液中加入2mlHEPES浓缩液，终浓度为20mmol/L本文档共63页；当前第33页；编辑于星期二\5点21分抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。最终使用浓度为每毫升100单位。

本文档共63页；当前第34页；编辑于星期二\5点21分制备1000mlRPMI

1640培养基RPMI

1640

干粉培养基10.4g（1包）

超纯水

400ml

↓

磁力搅拌至完全溶解

↓

加超纯水定容至1000ml

在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有0.22μm孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20℃保存备用。

用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。本文档共63页；当前第35页；编辑于星期二\5点21分消化液分离组织和分散细胞常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA)

单独或混合使用本文档共63页；当前第36页；编辑于星期二\5点21分胰蛋白酶溶液：

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用本文档共63页；当前第37页；编辑于星期二\5点21分胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks平衡盐溶液调成糊状，再补足D-Hanks平衡盐溶液（常用浓度为0.25%）搅拌混匀，置室温4小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，-20℃保存备用（以免分解失效），胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调pH至7.2左右胰蛋白酶溶液配制本文档共63页；当前第38页；编辑于星期二\5点21分EDTA·4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。

注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长本文档共63页；当前第39页；编辑于星期二\5点21分D-Hanks’

平衡盐溶液(D-HanksBalancedSaltSolutions,D-HBSS)KCl0.40gKH2PO40.06gNaCl8.00gNaCO30.35gNa2HPO40.048gD-Glucose1.00gPhenolRed0.01g

本文档共63页；当前第40页；编辑于星期二\5点21分2、

环境要求细胞培养必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性（1）温度（2）气相（3）PH本文档共63页；当前第41页；编辑于星期二\5点21分温度体外培养的细胞需要在保持一定恒温的环境中才能生长。在达到最适温度（37°）前，一般细胞繁殖率因温度的升高而增加，但是，温度逐步升高并超过最适温度时，繁殖会被抑制。当温度在25°-35°，细胞的生长速度很慢，但能够生存；细胞在4°也能存活数天；只要温度不低于0°，细胞都能生存；加了保护剂还能放到液氮中保存。当高温时，在41°-42°中培养1h，细胞损伤严重，43°以上，则多数细胞死亡。高温比低温对细胞的影响更为明显。本文档共63页；当前第42页；编辑于星期二\5点21分气相和PH5%CO2+95%空气混合气体（O2）。CO2既是细胞生长所需，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关。最适PH7.2–7.4低于PH6.8或高于PH7.6可能对细胞有害，甚至死亡。酚红指示剂：黄–6.6–橙–8.0–红本文档共63页；当前第43页；编辑于星期二\5点21分3、无毒无污染无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。若具细胞毒性，细胞容

易导致死亡。因此，选用器皿和材

料时必须注意。本文档共63页；当前第44页；编辑于星期二\5点21分无污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染细菌霉菌支原体体外培养的细胞缺乏机体免疫系统，无防御能力，一旦发生细菌等污染，细胞最终会死亡。交叉污染容易使细胞系失去原有特性。本文档共63页；当前第45页；编辑于星期二\5点21分三、细胞培养基本技术1、原代细胞培养2、传代细胞培养3、培养细胞生长状况的观察4、细胞冻存、复苏、运输本文档共63页；当前第46页；编辑于星期二\5点21分无菌操作中的注意事项在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁操作前,无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以75%或70%ethanol擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟操作时，小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用操作过程中注意，有菌意识，无菌操作！本文档共63页；当前第47页；编辑于星期二\5点21分1、原代细胞培养原理：将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胶原酶）或组织贴壁法处理，得到单个细胞或细胞群，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。仪器、材料及试剂：CO2培养箱，培养瓶、平皿、烧杯、吸管、移液枪、手术器械、计数板、离心机、水浴箱（37℃）1640/DMEMF12培养基（含10%血清），2%胶原酶II，PBS，酒精本文档共63页；当前第48页；编辑于星期二\5点21分组织消化法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2.处理组织：采集的标本必须在4H内完成。取出6-10cm长脐带，置于烧杯或平皿中，用PBS液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。本文档共63页；当前第49页；编辑于星期二\5点21分3.剪切：用手术剪将组织块剪成2~3立方毫米大小，然后再用眼科剪把组织剪细成1立方毫米的小块，以便于消化。加入与组织块总量1：1的2%胶原酶II，然后一并倒入瓶中，封口。4.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。37℃空气摇床100转/min，1.5-2h本文档共63页；当前第50页；编辑于星期二\5点21分5.分离：待组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，并倒入至少5倍体积的PBS稀释消化液，随即通过200目的不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。2500rmp离心消化20分钟，吸出上清，加入8-10mlPBS，1000rmp离心5min，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。6.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。7.换液：24-48H后观察细胞是否贴壁，如已有部分细胞贴壁，可换液继续培养。本文档共63页；当前第51页；编辑于星期二\5点21分2、传代细胞培养传代前的准备1.酒精，棉球，镊子，杂物盒，试管，吸管筒，离心管，培养瓶或板，计时器，笔2.0.25%胰蛋白酶3.含血清培养基，PBS本文档共63页；当前第52页；编辑于星期二\5点21分传代步骤（贴壁细胞）：1.镜下观察细胞生长至融合状态2.吸出旧的培养液，用无血清培养液或PBS清洗两次（切记要清洗干净）。3.消化细胞：最常用的方法是在培养瓶中添加1ml0.25%含EDTA的胰酶，培养箱中37°消化5-15s。可根据不同的细胞类型调整消化时间及程度。在电镜下观察，当细胞突起回缩，细胞之间间隙增大，细胞近乎缩成圆形即可。本文档共63页；当前第53页；编辑于星期二\5点21分4.终止消化：立即加入含有血清的培养基，用吸管吹打分散细胞，吹打动作不可过猛，力度要适中，否则容易损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。5.1000rmp离心5min，弃上清。6.用培养液重悬细胞，计数并调整细胞密度。本文档共63页；当前第54页；编辑于星期二\5点21分3、培养细胞生长状况的观察常规观察：培养液颜色（是否变黄）生长增殖变化（经历到哪个时期，长满否）形态变化（透明度、折光性、细胞轮廓）微生物污染（细菌、霉菌）可用显微镜观察活细胞及其动态本文档共63页；当前第55页；编辑于星期二\5点21分细胞生长状况的观察细胞计数：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

本文档共63页；当前第56页；编辑于星期二\5点21分1.

将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。

2.

将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3.

计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：

细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3

而

1ml=1000mm3

（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液本文档共63页；当前第57页；编辑于星期二\5点21分细胞生长曲线（细胞计数）细胞周期（流式）细胞分裂指数（细胞群中每1000个细胞中的分裂相数）细胞贴壁率本文档共63页；当前第58页；编辑于星期二\5点21分4、细胞冻存、复苏及运输及时进行细胞冻存十分必要：细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。细胞冷冻储存在