第十一讲蛋白质的分离与纯化二

二、简述题（每题10分共40分）蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法。预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的操作流程。本文档共35页；当前第1页；编辑于星期三\13点53分三、方案设计（10分） 某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对热稳定性较差，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否提高蛋白质的稳定性，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理。提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰。四、论述题（20分）：论述蛋白质一级结构测定的基本程序以及主要方法和原理。本文档共35页；当前第2页；编辑于星期三\13点53分概述常见色谱技术介绍第四节精制分离—液相色谱技术本文档共35页；当前第3页；编辑于星期三\13点53分1、液相色谱（Liquidchromatography）？利用不同物质在固定性和流动相中的分配特性不同，对物质的分离的技术。（理解）依据物质的理化特性（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）不同，在固定性和流动相中的分配系数不同流动相为平推流流动相流过固定相时，两相之间分配平衡很快不同物质的流动速度不同而实现分离。又称为层析（平推流）特点（四高）高效率、高纯度、高精度、高自动化程度——现代化色谱技术——高效液相色谱一、概述本文档共35页；当前第4页；编辑于星期三\13点53分1850年，德国化学家Runge将古罗马时期分析染料与色素的方法进行改进，发展成为纸色谱。1903年，俄国植物学家Tsweet在华沙生物学会议上发表分离植物色素的论文，1906年，Tsweet首次提出“色谱法”和“色谱图”的概念。 “色谱法”（Chromotography）“色谱图”（Chromatogram）1941年，英国生物化学家Martin与英国化学家Synge（获诺贝尔奖）创立液液分配色谱，以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸。1970年中期，微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析精度。80年代，色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了色谱—光谱联用、色谱—质谱联用、二维色谱（色谱—色谱）等技术。1990年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了高效液相色谱技术的发展。2、液相色谱法的发展本文档共35页；当前第5页；编辑于星期三\13点53分在色谱技术中，液相色谱（Liquidchromatography）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢。液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。20th60S’，将较为成熟的气相色谱理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展。特别是填料（色谱柱）制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。1969年，液相色谱仪商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为高效液相色谱法（HPLC）更加微量、快速、高效、广泛。新进展：微柱—HPLC、无孔色谱短柱—HPLC、毛细管—HPLC2、液相色谱的发展本文档共35页；当前第6页；编辑于星期三\13点53分吸附层析adsorptionchromatography分子筛层析molecularsievechromatography离子交换层析ionexchangechromatography亲和层析affinitychromatography分配色谱—液-液色谱疏水色谱—疏水作用等电点聚焦色谱—pI高效液相色谱—高度自动化的液相色谱3、液相色谱的类型本文档共35页；当前第7页；编辑于星期三\13点53分1、吸附分离色谱？（1）概念：利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术。（2）原理：通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）。不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同。通过连续的吸附—解吸附—再吸附过程将物质分离。

二、常见色谱介绍本文档共35页；当前第8页；编辑于星期三\13点53分（3）影响因素？吸附剂、溶剂、被分离物质的性质“三方面”吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用的固体物质。吸附剂选择原则：根据：吸附剂性质、溶剂的性质、被分离对象的性质——选择。表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。如何理解——选择原则？（三者之间相互影响关系）：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离物，选择极性较小的吸附剂，反之亦然。极性吸附剂、分离弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性物质、用强极性溶剂理想吸附剂和溶剂的选择：依据原则，依靠经验和多次试验。常用吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）氧化铝：多孔Al2O3，分三种：酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝活性炭：非极性吸附剂、常用于脱色和脱臭等吸附过程本文档共35页；当前第9页；编辑于星期三\13点53分层析方式（2种）：

柱层析：羟基磷灰石（HA），[Ca3(PO4)3OH2]，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。（分离并洗脱）薄层层析：（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析硅胶薄层层析：硅胶板分类（4类），硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)。硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化和合格检查：约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯：展层剂，Rf：苏丹黄>苏丹红>靛酚蓝，苏丹黄Rf约0.5，苏丹红和靛酚蓝Rf之差在0.1—0.2。分析程序：点样，展层，显色。本文档共35页；当前第10页；编辑于星期三\13点53分聚酰胺薄膜薄层层析：如：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度10-9—10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10nmol肽样品）。本文档共35页；当前第11页；编辑于星期三\13点53分单向纸层析本文档共35页；当前第12页；编辑于星期三\13点53分双向纸层析本文档共35页；当前第13页；编辑于星期三\13点53分薄层层析硅胶G板薄层层析本文档共35页；当前第14页；编辑于星期三\13点53分2、凝胶色谱：凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析 以具有筛孔的介质为固定相，依据分子大小进行物质分离的液相色谱技术。原理：分子在固相筛孔中自由扩散、渗透，不同尺寸的分子在筛孔中的分配系数不同，导致分子流动速度不同。流动相流动过程中，物质在凝胶内和凝胶外很快达到分配平衡。分子量大，排阻大，分子量小，排阻小，物质按分子量的大小流出分离柱。分子排阻范围为：0~100%。（排阻率为0和100的物质不能分离。Why？）如何理解？本文档共35页；当前第15页；编辑于星期三\13点53分凝胶色谱示意图分配系数（Kav）：分离组分在凝胶内水和外水体积中的比例关系。Kav=(Ve-V0)/ViVt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分别为：床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。Ve：分离组分流出的体积。分离物质的大小，0<Kav<1，Kav=0或Kav=1，不能分离。本文档共35页；当前第16页；编辑于星期三\13点53分凝胶种类和性质：种类：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等：常用种类和商品名称（根据分类对象选择凝胶材料）交联葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交联琼脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdes系列（高交联琼脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（琼脂糖）TSKgelSW系列（硅胶）TSKgelToyopearlHW系列，亲水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列亲水性聚乙烯TSKgelCW-35纤维素Cellulofine纤维素Chisso本文档共35页；当前第17页；编辑于星期三\13点53分操作程序：凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）凝胶柱的制备（柱选择：径长比约为：1:25—1:100，装柱、柱鉴定）平衡层析柱加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）凝胶柱的再生和保存应用：分离纯化、脱盐和浓缩、去热源物质分析检测（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c本文档共35页；当前第18页；编辑于星期三\13点53分（3）离子交换色谱：理解：依据电荷大小进行物质分离的液相色谱技术。原理：固相介质上结合有一定的离子基团。结合阳离子基团，称阴离子交换剂，其反离子为阴离子（如：Cl-）。在适当的条件下，反离子与分离物中的阴离子交换。在不同盐浓度或pH值下，将带不同电荷的物质洗脱下来。洗脱方式：洗脱剂分类：盐梯度洗脱；pH梯度洗脱。洗脱梯度分类：连续梯度；不连续梯度。本文档共35页；当前第19页；编辑于星期三\13点53分离子交换剂分类（2种）交换剂分类I（根据交换剂所带电荷：2大类）阳离子交换剂：交联阴离子基团，与阳离子交换。如：羧甲基（-O-CH2-COO-）阴离子交换剂：交联阳离子基团，与阴离子交换。如：氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）交换剂分类II（根据基质的组成和性质：2大类）疏水性离子交换剂（亲水性较小的合成树脂，如苯乙烯与二乙烯苯的聚合物）阳离子交换剂—带负电荷，电荷强弱（强酸型、中强型和弱酸型），反离子为正电荷离子阴离子交换剂—带正电荷，电荷强弱（强阴性、中阴性和弱阴性），反离子为负电荷离子螯合离子交换剂—具有络合一些金属离子、排斥另外一些离子的能力，选择性更高亲水性离子交换剂（亲水性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）阳离子交换剂阴离子交换剂本文档共35页；当前第20页；编辑于星期三\13点53分常用固定相介质DEAE（二乙基胺基乙基）—CelluloseDE-32DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM（羧甲基）-CelluloseDE-52CM-CelluloseCM-SephadexC-25(50)离子交换剂的选择依据物质在溶液中的电荷性质物质的吸附特性（疏水、亲水）实践和经验蛋白质分离本文档共35页；当前第21页；编辑于星期三\13点53分离子交换色谱操作程序洗脱方式：梯度洗脱——连续梯度和非连续梯度洗脱应用：物质分离、测定等电点（PI）凝胶预处理装住平衡上样洗脱再生本文档共35页；当前第22页；编辑于星期三\13点53分（4）亲和层析 利用分子间特异性可逆结合对物质进行特异性分离的液相色谱技术。原理：具有特异性亲和力的两个分子中，一个固定在不溶性的基质上，对另一个分子进行分离。（次级作用力相互作用的分子）固定在基质上的分子称配体，共价键与基质相连，构成固定相。流动相中的分子被特异性地与固定相吸附，使物质彼此分离。如：酶—抑制剂、抗原—抗体、A蛋白—Ag、配体—配基、过渡金属离子（Cu、Ni、Zn、Co等）与O、S、N等供电子基团形成配位键，可与蛋白质表面组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、色氨酸的吲哚基发生亲和作用。如Ni柱分离带有组氨酸标签的工程蛋白。操作程序：制备固相吸附剂（选择凝胶、专一性合成、分析鉴定）→装柱→平衡→上样吸附→清洗→解析分离→柱再生→平衡解析剂：低pH、高盐、竞争性洗脱剂、盐酸胍、尿素等变性剂等。（次级键）柱再生：高浓度盐、尿素等溶液等应用：物质分离、测定活性本文档共35页；当前第23页；编辑于星期三\13点53分亲和层析原理和程序——理解本文档共35页；当前第24页；编辑于星期三\13点53分（5）疏水性相互作用色谱

利用疏水作用将不同物质分离的液相色谱技术。原理：利用表面偶联疏水性基团的基质作为固相疏水吸附剂，流动相中蛋白质等大分子组分与疏水固定相发生疏水作用，依据分离物组分与固相吸附剂疏水作用的差异。分离物质按疏水作用由小到大的顺序分离开来。特点：疏水吸附剂：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基团。高盐溶液中，蛋白吸附能力强，高盐上样，降低盐度将蛋白洗脱分离。成本高，仅用于实验室小规模分离。本文档共35页；当前第25页；编辑于星期三\13点53分（6）反向色谱：利用表面非极性的基质为固定相，极性有机溶剂（包括水）为流动相，进行物质分离的色谱技术。特点：固定相表面完全被非极性基团覆盖，具有强的疏水性。固定相吸附剂：如：以硅胶为载体，硅烷化连接C4、C8、C18烷基或苯基。 典型代表：反相C18柱—常用C18硅烷化的硅胶为吸附剂，极性很小。极性流动相：其典型代表：甲醇和乙腈。类别：制备型色谱和分析型色谱应用：物质的分离和检测（定性和定量分析）当今液相色谱最主流的分离模式适于所有能够溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。本文档共35页；当前第26页；编辑于星期三\13点53分（7）分配色谱（也称液—液色谱） 利用分离组分在固定相与流动相之间溶解度的差异来实现分离的色谱技术。原理：分配色谱的固定相是液相溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者载体表面。本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。依据溶解度的不同，将组分分离。分类：正相色谱（normalphase）：是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的液相色谱体系。吸附色谱也属正相色谱。

极性键合固定相：键合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团分子的载体。反相色谱（reversedphase）：由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相体系的极性正好相反。非极性键合固定相：键合烷基、苯基等非极性有机分子。本文档共35页；当前第27页；编辑于星期三\13点53分（8）高效液相色谱

高效液相色谱是色谱的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂或缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在层析柱内各组分彼此分离，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样进行分析和制备的色谱技术。特点：高柱效、高精度、高灵敏度（微量）、高分辨率 ——快速全自动分析本文档共35页；当前第28页；编辑于星期三\13点53分主要由4部分组成：高压输液系统、进样系统、分离系统（主体）和检测系统。其它辅助装置：如梯度洗脱，脱气、自动进样及数据处理等。根据色谱柱和分离的原理不同，高效液相色谱分为多种类型（8.1）液相色谱仪组成高效液相色谱仪的结构示意图排阻色谱离子交换色谱吸附层析亲和层析分配色谱疏水色谱反向色谱聚焦色谱1234本文档共35页；当前第29页；编辑于星期三\13点53分

工作流程：高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，通过检测器的出口流出，注入欲分离样品，流动相将样品贮液器（上样环）的样品带入色谱柱进行分离，分离组分依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

8.2液相色谱仪工作流程光合细菌色素HPLC分析HPLC（USA，Angilent1100）上样操作流程本文档共35页；当前第30页；编辑于星期三\13点53分小结：要求掌握液相色谱概念、原理和基本操作流程高效液相色谱的原理和操作流程排阻色谱离子交换色谱吸附层析亲和层析分配色谱疏水色谱反向色谱聚焦色谱本文档共35页；当前第31页；编辑于星期三\13点53分1、纯化方案的设计（1）目的：从混合组分中提取纯化目的组分，设计方案，指导分离过程进行。（2）依据：分离物质的性质和特点，结合分离纯化方法的特点，对分离方法进行比较分析，选择出一种或几种方法的组合。（3）原则：各种分离方法各有特色，操作程序简繁不一；考虑分离对象的特性和结构，以及取材的特点；分离方案不是僵化的，在实验中，对方案进行不断修正、调节、完善；设计分离纯化方案表格—并进行试验验证，获得分离工艺。