第十章聚合酶链式反应技术演示文稿

第十章聚合酶链式反应技术演示文稿本文档共62页；当前第1页；编辑于星期三\14点47分第十章聚合酶链式反应技术本文档共62页；当前第2页；编辑于星期三\14点47分内容PCR的概念及技术的创建PCR的基本原理及特点PCR的反应体系和条件优化PCR产物分析PCR常用技术和应用本文档共62页；当前第3页；编辑于星期三\14点47分KaryBMullis

(1944-)

1983年发明了PCR技术

1993年度获得诺贝尔化学奖本文档共62页；当前第4页；编辑于星期三\14点47分本文档共62页；当前第5页；编辑于星期三\14点47分DNA的体内复制：原料：templateDNA（genomicDNA

），RNAprimer，dNTPs酶：解旋酶，引物酶，

DNA聚合酶，连接酶反应条件：胞液环境，37℃

反应过程：起始（模板DNA解链、形成引发体）、延长、终止（三阶段）产物：模板DNA（基因组DNA）拷贝数增加一倍PCR：templateDNA（genomicDNA，cDNA）,apairofspecificoligonucleotideprimer，dNTPsDNApolymerasebuffer，三种变化的温度（94，50-70，72℃），cycles（25-35）denaturation、annealing、extension（三阶段，多循环）目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍本文档共62页；当前第6页；编辑于星期三\14点47分PCR技术的基本原理属于无细胞的分子克隆，在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。本文档共62页；当前第7页；编辑于星期三\14点47分Denaturing95˚CAnnealingTm-5˚CExtension72˚CPCR的原理本文档共62页；当前第8页；编辑于星期三\14点47分PCR的过程（1）第一步

变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步

复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。本文档共62页；当前第9页；编辑于星期三\14点47分94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步

变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步

延伸（extend）（5）第五步

重复（repeat）本文档共62页；当前第10页；编辑于星期三\14点47分PCR反应条件变性95℃5min变性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃1min35cycles变性95℃延伸72℃退火Tm-5℃本文档共62页；当前第11页；编辑于星期三\14点47分PCR

PrincipletemplatedenaturatationPrimerannealingPrimerextension本文档共62页；当前第12页；编辑于星期三\14点47分PCR反应的特点特异性强引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性灵敏度高指数增长，从pg(10-12)可扩增至mg(10-6)水平简便、快速2～4小时完成扩增对标本的纯度要求低不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。本文档共62页；当前第13页；编辑于星期三\14点47分本文档共62页；当前第14页；编辑于星期三\14点47分PCR仪本文档共62页；当前第15页；编辑于星期三\14点47分PCR反应本文档共62页；当前第16页；编辑于星期三\14点47分标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加双或三蒸水至100ul本文档共62页；当前第17页；编辑于星期三\14点47分自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶

PCR体系组成TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①

热稳定性本文档共62页；当前第18页；编辑于星期三\14点47分最适温度：

72-78oC延伸速度：

约1000nt/min酶分子最长延伸长度：6.7kb②

最适温度高③

Taq酶的功能与缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3’5’外切酶活性。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。本文档共62页；当前第19页；编辑于星期三\14点47分金属离子敏感（尤其是Mg2+）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④

TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。本文档共62页；当前第20页；编辑于星期三\14点47分与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（

5‘端相同）的短DNA。（2）引物（primer)①位置3’

3’

本文档共62页；当前第21页；编辑于星期三\14点47分即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15-30bp。本文档共62页；当前第22页；编辑于星期三\14点47分③引物的碱基序列5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’

3’GCTAGCTACTTAAG5’

3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer本文档共62页；当前第23页；编辑于星期三\14点47分尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列.

5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’

CTGCCAGTCTAC3’

GACGG5’

T发卡结构1）2）本文档共62页；当前第24页；编辑于星期三\14点47分3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’

3’CAGGACTTAGTCACT5’

primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer本文档共62页；当前第25页；编辑于星期三\14点47分⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5oC。手工计算：一般估计：本文档共62页；当前第26页；编辑于星期三\14点47分⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.2mol/L。⑦简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。本文档共62页；当前第27页；编辑于星期三\14点47分设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer6.0等本文档共62页；当前第28页；编辑于星期三\14点47分dNTP呈颗粒状，保存不当易变性分解dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20℃冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（3）dNTP本文档共62页；当前第29页；编辑于星期三\14点47分（4）模板DNA但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。②

模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①

纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。本文档共62页；当前第30页；编辑于星期三\14点47分Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低

TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少（5）Mg2+本文档共62页；当前第31页；编辑于星期三\14点47分PCR反应条件优化

反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）本文档共62页；当前第32页；编辑于星期三\14点47分1、温度

变性温度：94-97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右，一般55-60℃温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性本文档共62页；当前第33页；编辑于星期三\14点47分2、时间

第一次变性应给予足够时间（5-7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为复性时间：30～60sec

延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min3-4Kb的DNA片段，延伸时间3-4min10Kb的DNA片段，延伸时间15min本文档共62页；当前第34页；编辑于星期三\14点47分3、循环次数

重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长本文档共62页；当前第35页；编辑于星期三\14点47分PCR反应曲线本文档共62页；当前第36页；编辑于星期三\14点47分PCR产物分析

AnalysisofPCRproductsGelanalysis(琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳):PCR产物电泳，EB（溴乙锭）染色，紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。本文档共62页；当前第37页；编辑于星期三\14点47分Restriction-endonucleasedigestionanalysis：酶切、电泳分离。产物的鉴定，基因分型，研究变异性。本文档共62页；当前第38页；编辑于星期三\14点47分Hybridization：

(Southernblot/dotblot)electrophoresis/hybridization本文档共62页；当前第39页；编辑于星期三\14点47分Sequenceanalysis：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。本文档共62页；当前第40页；编辑于星期三\14点47分常用PCR技术原位PCR(insituPCR)多重PCR（multiplexPCR）长距离PCR(Long-rangePCR)逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）巢式PCR（nestingPCR）-4条引物本文档共62页；当前第41页；编辑于星期三\14点47分原位ＰＣＲ（InsituPCR）原位聚合酶链式反应（InsituPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列本文档共62页；当前第42页；编辑于星期三\14点47分

原位PCR的作用

利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。本文档共62页；当前第43页；编辑于星期三\14点47分多重PCR（MultiplexPCR复合PCR）用于检测特定基因序列的存在或缺失。本文档共62页；当前第44页；编辑于星期三\14点47分电泳引物12341234本文档共62页；当前第45页；编辑于星期三\14点47分RT-PCR（reversetranscription-PCR）Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用逆转录酶，把mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。本文档共62页；当前第46页；编辑于星期三\14点47分RNAtemplate3’

5’

下游引物cDNAfirststrand3’

5’

上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’

5’

3’

5’

反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶本文档共62页；当前第47页；编辑于星期三\14点47分PCR-RFLP

(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)

限制性片段长度多态性1.分析已知突变。2.突变碱基涉及酶切位点的变化。PCR----酶切------电泳本文档共62页；当前第48页；编辑于星期三\14点47分PCR-RFLP5’CCACGG3’3’GGTGCC5’*5’CCATGG3’3’

GGTACC5’*ResistancetoNcoIDigestionSusceptibletoNcoIDigestion本文档共62页；当前第49页；编辑于星期三\14点47分HomozygousMutantHomozygousWild-typeHeterozygoteDirectionofElectrophoresisPCR-RFLP本文档共62页；当前第50页；编辑于星期三\14点47分SSCPPCRPCRATCGWildAmplifyregionofinterestedDenaturesamplesinFormamideorHeatATCGMutant本文档共62页；当前第51页；编辑于星期三\14点47分DenaturesamplesinFormamideandHeatATCGATCGDNAmoleculesconformationdependsontheirsequenceRunonaNon-denaturinggelandlookformobilitydifferencesWildMutantSSCP本文档共62页；当前第52页；编辑于星期三\14点47分点突变位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法不在酶切位点上的点突变：单链构象多态性分析法(PCR-SSCP)

致病基因上的未知点突变：PCR-SSCP（单核苷酸多态性，SNP）本文档共62页；当前第53页；编辑于星期三\14点47分实时荧光定量PCR(Real-timePCR)常规定量PCR技术：

—对PCR扩增反应的终产物进行定量

—重复性差

—半定量实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量

本文档共62页；当前第54页；编辑于星期三\14点47分实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Ct值是荧光定量PCR技术的一个很重要的概