受体配体课件

第八节

受体的放射性配体结合分析

（radioligandbindingassayofreceptors,RBA）

岳凌受体配体简一、总论

受体（receptor，R）

细胞膜上或细胞内能识别生物活性物质并与之结合，进而引起生物学效应的生物大分子。

2受体配体简

配体（ligand，L）

能与受体特异性结合的生物活性分子。配体

内源性配体外源性配体3受体配体简RBA

原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结合反应。应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定受体-配体复合物的放射性，经过数据处理，可求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。

4受体配体简RBA的分类

定量RBA

可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常以平衡解离常数表示）。

定性RBA

发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研究受体-配体的相互作用等。

5受体配体简RBA的应用

神经递质激素和药物等的作用机制疾病的病因和发病机制新药设计和药物筛选受体显像与受体介导治疗6受体配体简二、概述1.受体的分类类(class)膜受体核受体亚类（subclass）型(type)

亚型(subtype)7受体配体简2.受体与配体结合的基本特点1）可饱和性(saturability)2）特异性(specificity)3）适度的亲和力（affinity）4）可逆性(reversibility)5）识别能力(recognition)和生物效应的一致性8受体配体简受体与配体特异性结合的特点：亲和力高，结合容量小。亲和力：受体与配体的结合能力。平衡解离常数（equilibriumdissociationconstant，KD）指占据半数受体所需的配体浓度。KD值愈小，表明亲和力愈高；KD值愈大，亲和力愈低。9受体配体简三、单位点系统RBA的基本规律（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律

1.质量作用定律

k1,v1

[R]+[L][RL]

k2,v2

根据质量作用定律：

v1

=k1[R][L]v2=k2

[RL]10受体配体简

当反应达到平衡后，

v1=v2

即：

k1

[R][L]=k2

[RL]

则平衡解离常数（KD）的数学表达式（1.1）为：

KD＝k2＝[R][L]

k1[RL]11受体配体简2.饱和曲线(saturationcurve)1）饱和曲线当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线。12受体配体简2）设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的初始浓度，则有：

[L]=[LT]–[RL][R]=[RT]–[RL]

将上式代入(1.1)式，经整理得：

[RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0

13受体配体简

饱和曲线的形状和KD有关（如图1）。图1KD对饱和曲线的影响

14受体配体简饱和曲线曲线的高度取决于[RT]（如图2）。

图2[RT]对饱和曲线影响15受体配体简3.Scatchard作图

由式（1.1）整理可得：

KD＝[RT-RL][L][RL]

将上式整理可得：

[RL]=[RT]

－1_×[RL][L]KDKD16受体配体简

以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为Scatchard作图。简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为-（1/KD），横轴截距为[RT]，纵轴截距为[RT]/KD（见图3）。17受体配体简图3简单单位点系统RBA的Scatchard作图18受体配体简（二）非特异性结合

(non-specificbinding，NSB)

NSB

在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。NSB的特点

亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图4）。19受体配体简图4饱和曲线实验中TB、SB和NSB的关系20受体配体简在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性(totalbinding，TB)，必须减去NSB，才能得到特异性结合(specificbinding，SB)的数据。21受体配体简四、RBA的基本方法

离体RBA的基本方法可概述如下：

1.制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞组分的分离制备等）

2.加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等）

3.温育

4.分离结合和游离的放射性标记配体

5.测定结合部分的放射性

6.数据处理22受体配体简

标记配体的基本要求

1）高比活度

2）亲和力高

3）特异性强

4）放射化学纯度高23受体配体简五、定量RBA的数据处理定量RBA主要是通过已知标记配体的量和比活度，以及测得的样本的数据，应用数学模型求出受体的有关参数如受体密度[RT]、KD等。24受体配体简1.单点法实验的数据处理通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量（maximumbindingcapacity，Rmax）。受体密度的表示方式有以下几种：①胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白；②胞核的受体含量：fmol/mgDNA；③完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或

fmol/106细胞。25受体配体简单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式如下：

[RT]=_____________RL的cpm______________

探测效率（％）×配体比活度×标本的蛋白量（DNA量）或细胞数26受体配体简2.简单单位点RBA的多点法实验多点法实验可分为简单单位点和双位点(多位点)两方面，它们又可各自分为饱和曲线实验和竞争结合实验两类。

27受体配体简简单单位点饱和曲线的数据处理1.Scatchard模型以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，实际应用时，[RL]/[L]的浓度比值由放射性的比值B/F代表。28受体配体简具体公式如下：：

[RL]=B=[RT]

－1_×[RL][L]FKDKD以B/F对[RL]作图应为一条直线，斜率为-(1/KD)，直线与横轴的交点为[RT]值，与纵轴交点为[RT]/KD。29受体配体简2.计算机曲线拟合饱和曲线的直接表达式为：[RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0其中，[LT]是自变量（横坐标），[RL]是因变量（纵坐标），[RT]和KD是固定值。应用计算机以最小二乘法或稳健回归法进行曲线拟合，可以得到[RT]和KD的值。30受体配体简应用1.

放射受体显像：放射性配体与靶细胞上受体结合，显像。31受体配体简