新教材选修3-2PCR技术专题

新教材选修3—2PCR技术专题选修1专题2课题2PCR技术新教材选修3—2PCR技术专题自学提纲：知识回顾：分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；2.DNA复制过程和特点；技术概念及应用。基本概念：变性、复性、TaqDNA聚合酶、引物理解PCR技术的原理掌握PCR技术的全过程比较PCR技术和体内DNA复制的异同点。新教材选修3—2PCR技术专题一、基础知识（一）、PCR技术的概念是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百份的DNA拷贝（二）、PCR技术的应用遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定新教材选修3—2PCR技术专题PCR的应用1从蓝藻里面克隆SOD(超氧化物歧化酶)清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品基因库检索SOD的序列设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白新教材选修3—2PCR技术专题PCR的应用2检测粉末样品是否含有炭疽杆菌炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR新教材选修3—2PCR技术专题PCR的应用3基因测序新教材选修3—2PCR技术专题一、基础知识（三）、PCR技术的原理新教材选修3—2PCR技术专题1、体内DNA复制的条件：解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化DNA子链合成使DNA聚合酶能从引物3’端开始连接脱氧核苷酸变性（80-100）Taq聚合酶（耐高温）20—30个核苷酸构成,是一小段DNA或RNAATP提供能量新教材选修3—2PCR技术专题2、DNA合成的方向（1）DNA单链两端的命名①基本单位－脱氧核苷酸脱氧核糖磷酸T1号碳5号碳3号碳新教材选修3—2PCR技术专题连接ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端（含羟基）3，端5，端②DNA单链两端的命名新教材选修3—2PCR技术专题（2）DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。2、DNA合成的方向新教材选修3—2PCR技术专题（3）DNA合成的方向从子链由5’

端向3’端延伸新教材选修3—2PCR技术专题3、DNA复制的前提

——是______________

用_________________方法

思考：DAN复制的前提是什么？体外扩增DNA如何打开双链？双链的解开控制温度新教材选修3—2PCR技术专题DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）4、DNA分子的热变性原理：PCR仪原理变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合新教材选修3—2PCR技术专题思考：高温使DNA解旋，但普通DNA聚合酶会失活,

__________________找到耐高温DNA聚合酶P21托马斯.布鲁克新教材选修3—2PCR技术专题5、体外DNA复制的条件(PCR

反应的条件)①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶；⑤控制温度，但不需解旋酶.新教材选修3—2PCR技术专题以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率二、PCR的反应过程1、循环之前的一次预变性2、PCR一般要经历三十多次循环新教材选修3—2PCR技术专题（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。二、PCR的反应过程3、每个循环包括：变性——复性——延伸新教材选修3—2PCR技术专题（1）PCR循环--变性95℃变性新教材选修3—2PCR技术专题（1）PCR循环--变性95℃变性新教材选修3—2PCR技术专题（1）PCR循环--变性95℃变性新教材选修3—2PCR技术专题（2）PCR循环—复性55℃复性新教材选修3—2PCR技术专题（3）PCR循环—延伸新教材选修3—2PCR技术专题（3）PCR循环—延伸新教材选修3—2PCR技术专题（3）PCR循环—延伸新教材选修3—2PCR技术专题（3）PCR循环—延伸新教材选修3—2PCR技术专题4、循环特点：①上一次循环的产物为下一循环的模板②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代DNA分子中③其它子代DNA分子都为双引物分子式④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N①②练习：见课课练P79第10题新教材选修3—2PCR技术专题二、实验步骤：①准备好PCR反应体系的配方②用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分③盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁④离心10分钟⑤将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序⑥电泳检测PCR结果新教材选修3—2PCR技术专题三、操作提示：

操作提示

1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。目的：避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。新教材选修3—2PCR技术专题四、结果分析与评价1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰(图5-11)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。新教材选修3—2PCR技术专题四、结果分析与评价(了解)2、具体方法如下。1）．将样品进行50倍稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水。2）．以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计(图5-12)的读数调节至零。3）．加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。4）．根据下面的公式计算DNA含量。

DNA含量(μg/ml)=50x(260nm的读数)x稀释倍数新教材选修3—2PCR技术专题五、课题延伸1、PCR优点：2、PCR技术的意义原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作新教材选修3—2PCR技术专题复习：PCR技术与体内DNA复制的区别：1.PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；2.PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；3.PCR一般要经历三十多次循环，而生物体内DNA复制需要生物体自身的复制。新教材选修3—2PCR技术专题练习1、书本2、课课练新教材选修3—2PCR技术专题练习：见课课练P79第10题新教材选修3—2PCR技术专题9下图为PCR过程的前三次循环的图解，请据图回答：

(])请将PCR缓冲液中提供的4种组分填写在图中的方框内：

(2)第一轮循环中变性是指_____________________________；复性是指__________________________________________________；延伸是指___________________________________________________。

(3)假设PGR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为

Nl，第二轮的产物4个子代DNA为N2，第二轮的产物8个子代DNA为

N3，则Nl、N2、N3中分别含有模板DNA单链的DNA分子

，

__________________、____________________个，若继续循环36次，则N36中将有——个DNA分子含有模板DNA单链。

(4)N3的8个DNA分子中①②是以N2中的_____________为模板复制而来的，③④是以N2中的

为模板复制而采的，⑤⑥是以N2中的

为模板复制而来的，⑦⑧是以N2中的

为模板复制而来的。从图中可以看出，DNA聚合酶只能特异地复制处于2个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增，原因是____________________________________________________练习：见课课练P79第10题新教材选修3—2PCR技术专题练习二(课堂检测)1、DNA单链的________末端为3,端,________末端为5,端,在DNA复制时,引物从模板链的___端配对结合.在___________酶的作用下,引物提供____端,使子链向下延伸.2每次循环可以分