第二章基因工程操作常规技术(方)

PCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’

3’解旋酶解链酶

5’DNA解旋解链合成引物子链延长本文档共55页；当前第1页；编辑于星期三\11点32分5引物酶PCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长AUCGCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGGGAUCG

引物酶

5‘

RNA引物RNA引物本文档共55页；当前第2页；编辑于星期三\11点32分TAGCGCTATCGCATCGACGCT

GGAUCGAUCGCGPCR技术简史•DNA的复制••核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明

DNA解旋解链合成引物子链延长3’5‘

5‘3’5’3’

3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC

TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG

ATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶本文档共55页；当前第3页；编辑于星期三\11点32分PCR技术简史

•

DNA的复制•

核酸体外扩增的设想•

聚合酶链反应的发明•

1971年，Khorana提出：经过DNA

变性，与合适引物杂交，用DNA聚

合酶延伸引物，并不断重复该过程

便可克隆基因。•

但由于测序和引物合成的困难，以

及70年代基因工程技术的发明使克

隆基因成为可能，所以，Khorana

的设想被人们遗忘了……本文档共55页；当前第4页；编辑于星期三\11点32分PCR技术简史•

DNA的复制

•

核酸体外扩增的设想

•

聚合酶链反应的发明•

1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明

了聚合酶链反应（PCR）•

基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制•

最初采用E-coli

DNA聚合酶进行PCR，由于该

酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错•

耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进

行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动

化热循环仪•

1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖本文档共55页；当前第5页；编辑于星期三\11点32分Kary

B.

Mullis<<The

Unusual

Origin

ofthe

Polymerase

Chain

Reaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR

为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。本文档共55页；当前第6页；编辑于星期三\11点32分Mullis开车的时候,瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA……本文档共55页；当前第7页；编辑于星期三\11点32分PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。本文档共55页；当前第8页；编辑于星期三\11点32分PCR仪器的变迁三个水浴锅，用手移动（Mullis等人当时用的）电加热块＋自来水冷却（PE，1988）电加热块＋内置循环液冷却（PE，1989）三个加热块＋机械手（Stratagene，1994）半导体制冷和加热（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）温度梯度,荧光检测(如Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈,厦门安普利等）本文档共55页；当前第9页；编辑于星期三\11点32分PCR仪本文档共55页；当前第10页；编辑于星期三\11点32分721234522时间（min）

94

温

度（℃）

55

1

2

3

高温变性

低温退火

适温延伸重复1-3步25-30轮

目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性形成单链

DNA变性子链延伸

DNA加倍PCR的基本原理本文档共55页；当前第11页；编辑于星期三\11点32分94℃模板DNA本文档共55页；当前第12页；编辑于星期三\11点32分50℃

引物1

DNA引物引物2本文档共55页；当前第13页；编辑于星期三\11点32分72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶本文档共55页；当前第14页；编辑于星期三\11点32分94℃

第1轮结束

第2轮开始本文档共55页；当前第15页；编辑于星期三\11点32分50℃

•Taq

•

•

Taq

TaqTaq72℃本文档共55页；当前第16页；编辑于星期三\11点32分72℃

第2轮结束本文档共55页；当前第17页；编辑于星期三\11点32分本文档共55页；当前第18页；编辑于星期三\11点32分本文档共55页；当前第19页；编辑于星期三\11点32分PCR体系的主要组分和反应条件

标准的PCR反应体系4种dNTP混合物

各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaq

DNA聚合酶

2.5uMg2+

1.5mmol/L本文档共55页；当前第20页；编辑于星期三\11点32分1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng

DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。本文档共55页；当前第21页；编辑于星期三\11点32分(2)引物设计：a.序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。b.引物长度以15-40

bp为宜。c.碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。d.引物内部避免形成二级结构。e.两引物间避免有互补序列。f.引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。本文档共55页；当前第22页；编辑于星期三\11点32分引物浓度

mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermus

aquaticus)

U/50

l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。本文档共55页；当前第23页；编辑于星期三\11点32分（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。本文档共55页；当前第24页；编辑于星期三\11点32分（5）

Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；

Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。本文档共55页；当前第25页；编辑于星期三\11点32分2）PCR的条件(1)

变性使双链DNA解链为单链94℃

20-30s(2)

退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。本文档共55页；当前第26页；编辑于星期三\11点32分（3）延伸70-75℃，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加本文档共55页；当前第27页；编辑于星期三\11点32分Reaction

Condition

for

a

Typical

PCR

Assay本文档共55页；当前第28页；编辑于星期三\11点32分Typical

PCR

Thermal

Profile*Thiscycleis

normallyincludedin

a

PCRassayin

order

toallow

any

“unfinished”

productfromprevious

amplificationtoachieve

itsfull

length本文档共55页；当前第29页；编辑于星期三\11点32分

PCR动画1stcycle2ndcycle3rdcycle过程变性引物退火DNA复制本文档共55页；当前第30页；编辑于星期三\11点32分•灵敏度高1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平2.

能从100万个细胞中检出一个靶细胞••简便、快速

1.一次性加好反应液，2～4

小时完成扩增

2.扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低

血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的特点本文档共55页；当前第31页；编辑于星期三\11点32分PCR的应用•

研究–

基因克隆，DNA测序，分析突变•

诊断–

细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•

人类基因组工程–

遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•

法医–

犯罪现场标本分析•

肿瘤–

各种肿瘤检测•

其他……本文档共55页；当前第32页；编辑于星期三\11点32分

1)

基因克隆重组DNA质粒DNA基因片段本文档共55页；当前第33页；编辑于星期三\11点32分

2)

基因检测内源性病变基因A

A’正常人

病人

人病原微生物基因

正常人

(-)

病

人

(+)本文档共55页；当前第34页；编辑于星期三\11点32分遗传病的诊断地中海贫血珠蛋白链合成不平衡HBA1、HBA2第11号染色体上的HBB基因本文档共55页；当前第35页；编辑于星期三\11点32分恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）PCR-RFLP（限制性核酸片段多态性）法：限制性内切酶Ras基因本文档共55页；当前第36页；编辑于星期三\11点32分突变限制性内切酶正常突变电泳本文档共55页；当前第37页；编辑于星期三\11点32分父

'父子母

亲子鉴定本文档共55页；当前第38页；编辑于星期三\11点32分现

嫌1嫌2

嫌3

犯罪现场调查本文档共55页；当前第39页；编辑于星期三\11点32分1）不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究PCR的类型限制性引物(低浓度引物)本文档共55页；当前第40页；编辑于星期三\11点32分高浓度引物低浓度引物本文档共55页；当前第41页；编辑于星期三\11点32分

2)反向PCR

(reverse

PCR)

是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。

可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列本文档共55页；当前第42页；编辑于星期三\11点32分已知序列未知序列

限制酶

未知序列限制酶连接酶本文档共55页；当前第43页；编辑于星期三\11点32分3）多重PCR用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物本文档共55页；当前第44页；编辑于星期三\11点32分4）LP-PCR（Labelled

primers)利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观地检测目的基因。特别适合大量临床标本的基因诊断可同时检测多种基因成分病毒1病毒2病毒

3病毒4本文档共55页；当前第45页；编辑于星期三\11点32分标记引物PCR观察PCR产物本文档共55页；当前第46页；编辑于星期三\11点32分用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。5）锚定PCR本文档共55页；当前第47页；编辑于星期三\11点32分

cDNA

末端核酸转移酶5’CC…CC

锚定引物

5’3’GG…GG

3’GG…GG

CC…CC

3’GG…GG

CC…CC5）锚定PCR本文档共55页；当前第48页；编辑于星期三\11点32分6）原位PCR1990年Haase等首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。

直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位。

适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。本文档共55页；当前