第二章基因工程主要技术原理DNA序列分析

目的与要求掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。重点：

Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法难点：如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列学时：2学时学习方法：课堂讲授与讨论相结合本文档共30页；当前第1页；编辑于星期三\11点31分2.3.1Sanger双脱氧链终止法■

2.3.2Maxam－Gilbert化学修饰法■

2.3.3序列分析自动化■2.3.4杂交测序■2.3.5DNA策序的商业运作及存在问题■2.3.6思考问题■本文档共30页；当前第2页；编辑于星期三\11点31分2.5.1Sanger双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实。第一，如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。1965，Cornall大学以S．W．Holle，为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回DNA核酸序列分析历程本文档共30页；当前第3页；编辑于星期三\11点31分1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（Dr．RayWu）独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了λ噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；M．Smith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。引物—延伸测序策略本文档共30页；当前第4页；编辑于星期三\11点31分2.5.1.1Sanger双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2’，3’双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。本文档共30页；当前第5页；编辑于星期三\11点31分反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶1、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。考考你：反应混合物中，标记什么最方便？本文档共30页；当前第6页；编辑于星期三\11点31分GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你本文档共30页；当前第7页；编辑于星期三\11点31分酶、原料比例在实际的DNA合成反应中，使用失去了5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。dNTP／ddNTP=1：100时，谱带分离效果较佳，可读出多于200个以上的核苷酸顺序。降低ddNTP对dNTP浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出300个左右的核苷酸顺序。dNTP／ddNTP与良好的电泳谱带模式的关系如何？本文档共30页；当前第8页；编辑于星期三\11点31分2.5.1.2Sanger双脱氧-M13体系DNA序列分析法引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷分析：这样处理后，能策得高分子量DNA吗？为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序“拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。本文档共30页；当前第9页；编辑于星期三\11点31分这些供作序列测定的DNA片段绝大多数都仅为数百个核酸。因此需要用物理方法分离大量的DNA片段。费时费钱，因为商品提供的核酸内切限制酶的价格是十分昂贵。为了保证能够获得所有的限制片段，就需要制备足多数量的DNA，而其中有许多步骤都要用不同浓度的凝胶进行电泳再纯化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。本文档共30页；当前第10页；编辑于星期三\11点31分克服缺点的一种途径—DNA分子克隆将不同限制酶消化切割的DNA限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链DNA噬菌体，例如M13作为载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交。称做“通用引物”。本文档共30页；当前第11页；编辑于星期三\11点31分M13载体克隆DNA片段将DNA片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。重组体噬菌体，在含有IPTG和Xgal的培养基平板上形成白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。本文档共30页；当前第12页；编辑于星期三\11点31分当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。本文档共30页；当前第13页；编辑于星期三\11点31分使用M13载体系列的优点所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。最初使用的引物，是克隆在PBR322质粒载体上的一种短的限制片段。以后J．Messing等人（1981）发展出了一种更加适用的长度为15bp的合成引物，这段引物同M13的其它位点之间有低度的同源性，后来又合成出了改进的同M13其它任何位点均无同源性的引物。现在，应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采用的快速的DNA序列分析法。本文档共30页；当前第14页；编辑于星期三\11点31分2.5.1.3Sanger双脱氧一pUC体系DNA序列分析法自引入M13载体系列，DNA序列分析又有了新的改良和发展。起初是使用Klenow片段，现在则可以使用反转录酶或T7DNA聚合酶。以往都是把待测DNA片段克隆到M13mp载体上，得到单链模板后，再按双脱氧链终止法进行序列分析。现在，可以将待测DNA片段克隆到质粒载体上，直接用闭合环形的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作DNA序列分析。这种方法特称为利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法。由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，所以又称之为Sanger双脱氧链终止-pUC体系DNA序列分析法。本文档共30页；当前第15页；编辑于星期三\11点31分Sanger双脱氧一pUC体系DNA序列分析法基本步骤待测DNA与pBR322或pUC分子重组；转化：转化反应物涂布在补加有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，经37℃过夜培养；挑选白色菌落，制备质粒NA。碱变性处理，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。优点：无需将DNA克隆到M13载体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。返回目录本文档共30页；当前第16页；编辑于星期三\11点31分2.5.2Maxam－Gilbert化学修饰法是1977年由美国哈佛大学的A．M．Maxam和W．Gilbert

发明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。返回目录本文档共30页；当前第17页；编辑于星期三\11点31分2.5.2.1Maxam－Gilbert化学修饰法的原理化学试剂处理末端标记DNA片段，碱基的特异性切割产生的DNA片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。本文档共30页；当前第18页；编辑于星期三\11点31分出发材料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的末端带有放射性标记的DNA片段(双链或单链）关键：4种核苷酸碱基中，有1～2种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。本文档共30页；当前第19页；编辑于星期三\11点31分碱基特异的化学切割反应——肼专用试剂有硫酸二甲脂和肼。肼又叫做联氨（NH2·NH2），在碱性的条件下，它能够从C4和／或C6原子位置作用于T和C两种碱基，并用C4-C5-C6环化形成一种新的5原子环。联氨的进一步作用释放出吡唑琳酮环，留下的嘧啶碱基的N1－C2－N3片段则仍然连接在糖环上。在具有六氢吡啶的条件下，通过β-消除反应，2个磷酸分子便会从糖片段上释放出来，从而导致在这个核苷酸位置上发生DNA链的断裂。反应体系中加入lmol/L浓度的盐，肼同T的反应速率便会逐渐下降，以确保发生C特异的化学切割反应。根据这一特点区别C和C+T之间的降解产物。本文档共30页；当前第20页；编辑于星期三\11点31分硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应（G

N7原子和A

N3原子）。中性PH，甲基化导致配糖键水解，留下失去碱基的糖片段作为糖一磷酸骨架上的键。这种键十分微弱，易于通过碱催化的消除反应使围绕在糖片段两翼的磷酸脱落，造成DNA断裂。由于A

N3原子的甲基化比GN7原子慢，故3-甲基A的配糖键比7-甲基G脆弱。所以前者的水解速率比后者快4～6倍。速率上的差别，是早期分析辨别DNA中的G和A的基本依据。最近采用六氢吡啶同DNA甲基化反应，而这种反应对甲基化的G是特异的。因此，DNA链的断裂只在G发生。本文档共30页；当前第21页；编辑于星期三\11点31分本文档共30页；当前第22页；编辑于星期三\11点31分2.5.2.2化学修饰法测序图解本文档共30页；当前第23页；编辑于星期三\11点31分CT+CG+AAAACAGTCCTACCGCTGAAGCAG+AT+CC试试看你作对了吗？本文档共30页；当前第24页；编辑于星期三\11点31分2.5.2.3Maxam－Gilbert化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应单双链都可以需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行返回目录本文档