荧光定量PCR实验指南

。。--可编辑修改-荧光定量PCR〔一〕一、根本步骤：1、目的基因〔DNAmRNA〕的查找和比对；2、引物、探针的设计；3、引物探针的合成；4、反响体系的配制；5、反响条件的设定；6、反响体系和条件的优化；7、荧光曲线和数据分析；8、标准品的制备；二、技术关键：1、目的基因〔DNAmRNA〕的查找和比对；从“:///网点的“:///网点的genbank种：一为翻开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再翻开DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“import”，翻开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq“filopenentrezsequenc.seq然后要对全部的序列进展排序。用DNAstar软件中的Seqmansequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的全部文件，点击“add”或“addall”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进展比较。横线的上列为全都性序列，全部(contigpercentage”80contig“reassemblecontig”即可。选择凹凸的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimummathpercentage”的值。有时因此个别序列缘由，会消灭重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观看是否全部为全都性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不行用的。2、引物和探针设计引物设计细心地进展引物设计是PCR可以增加特异性的引物所具有的令人满足的特点：序列选取应在基因的保守区段；扩增片段长度依据技术的不同有所分别：sybrgreenITaqman50bp－150bp；避开引物自身或与引物之间形成44避开引物自身形成环状发卡构造；182424核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。Tm55－65℃，GC40%－60%；引物之间的TM相差避开超过2℃；3’端避开使用碱基A；3’33为避开基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。Taqman探针设计一般设计原则：探针位置尽可能地靠近上游引物；－70%。探针的5’端应避开使用碱基G。整条探针中，碱基C的含量要明显高于G为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，假设觉察有非特异性互补区，建议重设计引物探针。“:///BLAST)“(/BLAST)TaqmanMGB探针设计介绍MGBMGB(14-20bp)，更简洁找到全部排序序列的较短片段的保守区。(14-20bpMGBTm值将提高1Tm值的要求。MGB5GG灭基团的荧光信号。用primerexpress软件评价TmTm65-67℃。尽量缩短TaqmanMGB13bp。尽量避开消灭重复的碱基，尤其是G44个以上的G原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进展SNP检测时，为了检测到突变子，即TaqmanMGB1/343’端3’端2个碱基的前方(即必需确保探针的后两个碱基是确定的保守)，以进展SNP检测。反过来，假设要进展同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可到达即使是突变，仍可检测到突变。实时多重PCR多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，目的片段，反响中参加SYBRNTm多重实时PCRTaqman探针、或同时为MGBBeacon在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析:设计好各对引物和探针后，重在用DNAstarPrimerselect一文件中的多重PCR计的多重探针后，在“report”菜单下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告知此对引物有多少个dimerdGdGdG3、影响PCR及荧光PCR的其他因素引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进展设计对于实时荧光PCR合理的设计意味着确定的失败。但是，好的设计并不等于好的试验结果，影响PCR和荧光PCR引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度〔Tm〕。这是当50DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在抱负状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以削减非特异性结合。合理的退火温度从5570℃。退火温度一般设定比引物的Tm5℃。TmTm分析法——从序列一级构造和相邻碱基的特性推测引物的杂交稳定性oligo动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进展：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会削减引物二聚体和非特异性TmTm差异假设超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。假设两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm5℃。或者为了提高特异性，可以在依据较高Tm5个循环，然后再依据较低Tm为严谨的条件下可以获得目的模板的局部拷贝。引物浓度0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm〔OD260〕测量光密度值。然后使用光吸取值和微摩消光系数的倒数〔nmol/OD〕，通过Beers法则〔公式1〕计算引物浓度。2DNA物的准确浓度必需使用计算的消光系数。这是由于引物较短，碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数〔OD/μmol〕和消光系数的倒数〔μmol/OD〕。一般商业合成的引物以O.D20O.D.100ul50pmol/ul〔50μM〕OLIGO系数〔OD/μmol〕，计算出肯定的工作浓度下，引物的加水量。浓度(μM)＝A260〔OD/ml〕×稀释系数×消光系数的倒数〔nmol/OD〕举例：计算某寡核苷酸〔1ml〕，10μl100〔990μl〕水中。在A2600.24.8nmol/OD，代入得：浓度＝0.2〔OD/ml〕×100×4.8〔nmol/OD〕＝96nmol/ml＝96μM3.3引物、探针的纯度和稳定性3.3引物、探针的纯度和稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是由于DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基参加时使用重复化学反响，使DNA从3”到5”合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶100μM。也可以用双蒸水溶解。引物的稳定性依靠于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶TE-206〔1530℃〕1干粉引物可以在-201〔15℃30℃〕2探针即寡核苷酸进展荧光基团的标记探针标记效率和纯度有很大的区分。由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的状况下，最好稀释成2uM〔10×〕，作为工作浓度分装多支，避光保存。3.4热启动PCRPCRTaqDNA72℃，PCR一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点由于遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制TaqDNAPCRPCR一种根本成分延迟DNAPCRTaqDNA。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。Transitor®HotStartTransitor®HotStartTaq酶对于自动热启动PCRTransitor®HotStartTaq是在常规Taq酶的根底上进展了化学修饰，使得该酶在低温或常温下没有酶活，因此在加样至PCR修饰集团会被剪切，从而释放酶活。此外，随着PCR扩增的进展，酶活会被逐步释放，有效提高扩增效率及产物量。Transitor®HotStartTaqDNA95℃保温过程中要持续20分钟才会被释放到反响中，从而完全恢复聚合酶活性。3.5镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最正确的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μMdNTP的实时定量PCR，使用35mM〔一般PCR1.5mM〕。较高的游离镁离子浓度可以增加PCR1mM3mM，0.5mMTransitor®HotStartTaqTransitor®HotStartTaqDNATaqDNA广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化。模板质量模板的质量会影响产量。DNAPCR。一些在标准基因组DNASDS0.01DNA的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA。应留意进展PCR反响的模板质量，以增加PCR反响的成功率。模板浓度起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光PCR104106〔或在溴化乙锭染色胶上观看到〔下表〕。举例说，100ng1μg3×1043×105PCRDNA比较小，因此参加到PCRDNApg10－100ng做一个梯度稀释，对于定量PCR表1.基因组大小和分子数目的比例基因组DNASize(bp)*TargetMolecules/µg基因组DNASize(bp)*TargetMolecules/µgofGenomicDNAAmountofDNA(µg)for-10^5MoleculesE.coli4.7×10^61.8×10^80.001Saccharomycescerevisiae2.0×10^74.5×10^70.01Arabidopsisthaliana7.0×10^71.3×10^70.01Drosophilamelanogaster1.6×10^86.6×10^50.5Homosapiens2.8×10^93.2×10^51.0Xenopuslaevis2.9×10^93.1×10^51.01.0Musmusculus3.3×10^92.7×10^51.0Zeamays1.5×10^106.0×10^42.0pUC18plasmidDNA2.69×10^33.4×10^111×10^(-6)3.83.8防止剩余〔Carry-over〕污染PCR易受污染的影响，由于它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板为剩余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA〔非剩余污染〕。可以在PCR过程中使用良好的试验步骤削减剩余污染eppendorfPCR手套。总是使用不含有模板的阴性比照检测污染。使用预先混合的反响成分，而不是每个反响的每个试剂单独参加。一种防止剩余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶〔UDG〕。这种酶〔也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG〕移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNAUDG敏感，全部可以在PCRUDG荧光定量荧光定量PCR〔二〕1、高产量，特异和敏捷的定量PCR影响PCR定因素是使用优质牢靠的产品。使用优质、性能牢靠的热启动酶、优质的dNTP、MgUNG/dUTPPCR以下步骤的预备：设计引物和探针、合成引物和探针、正确贮存、得到高质量的模板，随后，您仅需要进展退火温度的优化，就能得到好的试验结果。FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕同竞争对手的定量PCRPCR您所宠爱的扩增条件，检测方法和设备。实时定量PCR是快速增长的PCRFQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕是一种便利使用的反响混合液，为定量分析进展了优化。它包含了荧光PCR〔如缓冲液，dNTP，聚合酶〕。只需参加您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR您可以利用成套的hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，来配制不含有UNG/dUTP统的热启动荧光PCR您也可以选择hotstartTaq，UNGdNTPS,来配制含有UNG/dUTP动荧光PCR您可以从试验角度得到多种选择，得到高产量、特异和敏捷的定量PCR试剂体系！高产量和特异性的扩增FQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕PCR用的TaqDNA您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG〔尿苷酸DNA糖基化酶〕防止剩余污染的力量防止了非模板DNA在产量和灵敏度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕的灵敏度极高〔阈循环高度敏捷性除了灵敏度和特异性外，UniversalPCR高度敏捷性除了灵敏度和特异性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析设置，检测方法和设备上给您供给了较高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您可以：对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于供给了附加的氯化镁，所以您可以便利地配置Mix体系。可以更敏捷的进展一般PCR和荧光PCR。ABIPrism®7700,ABIGeneAmp®5700Bio-RadI-Cycler。可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®探针和MolecularBeacon，您不必局限于特定的试剂盒。您还可以敏捷的选择进展自配荧光PCR体系，不管是含UNG/dUTP防污染系统还是不含该系统的。2、反响体系配制：2、反响体系配制：A2023A0101试剂盒：〔探针体系〕FQ-PCRMasterMix-UNG(2X)25ul〔1×〕；上游引物〔50~900nM〕〔200nM〕，下游引物〔50~900nM〕〔可200nM〕；探针〔200nM〕；待检样品5ul〔10~100ng〕；无菌去离子水补足，使总体积到达50ul。您可以选择荧光染料SYBGREEN20-50ulA2023A0106试剂盒:反响体系终浓度(自配热启动荧光系统)：1-2U的hotstartTaq3-5.5mM的Mg20.2mM的dNTP、×PCRbuffe〔A2023A010；50－900nM〔200nM〕50－900nM〔200nM〕200nM2-5ul20－50ul自配热启动荧光－UNG体系：1-2UTaq1×PCRbuffer、2.5-4.0mMMg2+〔A2023A0105〕；0.2-1UUNG(A2023A0107)〔可先设为0.5U〕、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP〔要调整〕(A2023A0108)；50－900nM的上游引物〔可先设200nM〕、50－900nM的下游引物〔可先200nM〕、200nM2-5ul20－50ul3、反响体系和条件的优化:PCRFQPCRMASTERMix-UDG〔hotstart〕，优化参数最少。您只需要优化退火温度，就可以得到更灵敏、更牢靠的定量结果。对于特别构造的荧光PCR，您可以优化引物浓度，来得到更特异或更灵敏的结果。使用通用PCRMasterMix试剂盒进展反响体系的配制，可以适合更多的反响体系，如mRNA的一般RT-PCR检测，适用于合成质粒的PCR，同时也适用于荧光PCR，范围更宽。承受成套的hotstartTaq酶kit(A2023A0106)，该试剂盒中含有进展热启动荧光核心试剂1、您需要对酶量和镁离子浓度进展优化。酶的推举反响浓度为1.25－1.5U〔50ul〕，必1-2UMg离子推举浓度一般PCR1－3mM,荧光PCR3－5.5mM，请在该范围内探讨最正确条件。2、试剂盒中供给的dNTPPCRdNTP0.2mM3200nM50nM－900nM之间进展探讨。4、如选用Taqman200nM，不须探讨。选择其他种类的探针需依据要求设置探针浓度。5火温度，退火时间和循环数。6、DNA100ng