遗传学教材 10第十章 遗传工程配套课件

第十章遗传工程

本章主要内容

第一节遗传工程的概念及其发展概况第二节基因工程第二节基因组学

第一节遗传工程的概念及其发展概况★遗传工程一般可分为广义和狭义的两种。广义的遗传工程包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。狭义的遗传工程即是通常讲的基因工程。本节只介绍基因工程。★基因工程中的DNA重组主要是指创造自然界中没有的DNA分子的新组合。这种重组不同于经典遗传学中经过遗传交换产生的重组。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的基因操作技术。★从细胞和组织中分离DNA。★利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restrictionendonucleases)酶切DNA分子，制备DNA片段。★将酶切的DNA片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。★将载体与DNA片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后，该重组DNA分子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clones)。★重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝。★能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。★克隆的DNA能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定基因产物。第二节基因工程

基因工程的内容限制性内切核酸酶载体基因的分离与鉴定基因工程的应用目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离一、基因工程的内容

重

组

DNA

技

术二、限制性内切核酸酶

★限制性内切核酸酶或限制性酶(restrictionenzymes)是细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子的一类酶。以限制(restriction)或阻止病毒侵染。★限制性酶据其作用特点，可分为两类。

※第Ⅰ类限制性酶每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性。

※第Ⅱ类限制性酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。第Ⅱ类限制性酶识别的序列是对称的，即在一条链中从5’到3’方向的序列，与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同。这种从两个方向阅读而序列相同的序列称为回纹对称序列(palindrome)。三、载体

一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。载体DNA分子需要具备的条件：具复制原点(ori)，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源DNA片段一起复制，具有多克隆位点(multiplecloningsite,MCS)，而每一种酶的切点只有一个，用于克隆外源DNA片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内。至少具有一个选择标记基因，使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。易从宿主细胞中回收。

1.细菌质粒

◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。◆早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。☆现在广泛使用且商品化的质粒，很多都具有重组表型检测标记，在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。2.λ噬菌体

◆

λ噬菌体基因组全长49kb。λ噬菌体DNA中间约三分之二的序列为中间基因簇(centralgenecluster)，位于两端的为DNA左、右臂。λ基因组的中间基因簇序列可被外源DNA片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。◆λ噬菌体载体可接受15kb-23kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，在基因库筛选中，λ噬菌体作载体与细菌质粒相比，具有易操作、阳性克隆数多等特点，现广泛用于各类基因库的构建。

3.柯斯质粒

◆柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9－5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)和细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的，而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因◆可接受长达50kb的外源DNA片段，这在克隆真核生物基因中十分有用，因为一个DNA片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。还与YAC克隆系统结合，用于基因作图分析。4.穿梭载体

◆穿梭载体(shuttlevectors)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物(如大肠杆菌)中复制，又能在真核细胞(如酵母)中复制的载体。因此，这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(Autonomouslyreplicatingsequence,ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。

5.细菌人工染色体

◆

BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒，约100kb，它能在细菌接合时转移1000kb的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体，可用于克隆100kb以上的DNA片段。◆带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持DNA大分子，尤其是重复序列多的DNA大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小，如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9－7)，仅带有自我复制、控制拷贝数(repE)及质粒分配(parE，parA,parB)所必须的最少序列。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。在多克隆位点两侧，还有T7及SP6启动子位点，用于制备RNA分子，进一步分析克隆的基因表达，作为染色体步行的探针，以及序列测定克隆的片段。6.酵母人工染色体◆酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）是另一类酵母穿梭载体。同YEp载体一样具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100-1000kb的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体(humanartificialchromosome，HAC)的研究。7.Ti质粒及其衍生载体

◆Ti质粒是一种细菌质粒(图9－9)，它自然存在于一种革兰氏阴菌——土壤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤(growngalltumors)。◆根瘤细胞的形成是因为土壤农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞(tumor-inducing,Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA(transferDNA,T-DNA)，当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine),作为土壤农杆菌的碳源和氮源◆

Ti质粒具有五个主要功能区域(图9－9)，它们分别是T-DNA、质粒转移(plasmidtransfer)、冠瘿碱代谢(opinecatabolism)、复制原点(ori)和毒性区域(vir)。◆

T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其它序列交界处的25bp不完全直接重复(imperfectdirectrepeats)，右端的序列称为右界(rightborder,RB),左端的为左界(leftborder,LB)。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。◆

Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的。

Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作

Ti质粒特点

四基因的分离与鉴定(一)从基因库中分离基因(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因

构建基因库基因库(library)是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因库中分离基因，首先要构建基因库。只有利用合乎要求的基因库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。核基因库◆核基因库(genomiclibrary或genomicbank)是将某一生物的全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的。◆通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度(大于15kb)的DNA片段，与适宜的载体(如EMBL)连接构成重组DNA分子,根据所用的载体，选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体或cosmid，BAC或YAC等(一)从基因库中分离基因

◆理想的核基因库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则总克隆数目少，因此，构建核基因库时常要选择能接受较大片段的载体。◆检测构建的核基因库是否包括一个完整的基因组序列，可用下面的公式计算：

◆例如人类基因组DNA分子量为3.0x106kb,以λEMBL作载体，插入片段的平均长度为17kb，P为99%时构建的基因库应有8.1x105个

重组噬菌体。构建基因库——（1）核基因库(2)染色体基因库

◆将基因组的一部分（如一条染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。◆例如果蝇X染色体上的一个片段，具有50多个多线染色体带(polytene)，利用微切割技术将这一段染色体切割，抽提DNA用限制性酶酶切后，克隆到噬菌体上构建成染色体片段基因库。◆在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术(flowcytometry)将人类染色体分开后，用于构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。◆在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳(pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE)方法，将酵母菌的16根染色体据其分子量大小分开后，用于构建染色体库。(3)cDNA库◆cDNA库是以mRNA为模板，经反转录酶(reversetranscriptase)合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)构建的基因库。◆绝大多数真核生物mRNA的3′端具有一段多聚A(poly-A)尾端序列。利用一段多聚T(poly-T)为引物(primer)，与poly-A互补配对，在反转录酶作用下，用poly-T引物引导合成一条互补DNA，即第一条DNA链，结果形成RNA-DNA杂合双链(图9－10)。然后合成第2条链。◆对没有poly-A尾端序列的RNA分子，可用寡聚六苷酸(hexamer)为引物合成第一条链，再用上述方法得到双链DNA。◆得到的双链DNA分子经两端补齐后，以与带有限制性酶切点的人工接头连接，酶切后与载体(通常是λ噬菌体)连接，再制备cDNA库。◆

cDNA库仅具有用于分离mRNA的细胞或组织内表达的基因的mRNA序列，所以它仅包括基因组的部分基因序列。◆在实际工作中，构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如果要分离在某一细胞或组织高效表达的某种基因，可用该细胞或组织的mRNA构建cDNA库，则很容易得到这个基因。◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基因的调控序列。(3)cDNA库2.筛选基因库

◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。◆大多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。◆如菌斑杂交法(plaquehybridization)筛选λ噬菌体核基因库。◆将经重组噬菌体(来自构建的基因库)感染的宿主细菌细胞与少量上层培养基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。◆再将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，然后用标记的探针(也变性成单链)与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用X-光片放射自显影，检测杂交信号。◆凡是与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号在膜上的相对位置，定位找出培养皿中所对应的噬菌斑，挑出、培养阳性噬菌斑，制备DNA，用作进一步分析。菌斑杂交法筛选λ噬菌体核基因库3.阳性克隆的分析与鉴定（1）限制性酶图谱◆构建阳性克隆的限制性酶图谱常是分析阳性克隆的第一步。根据同源性分析，可以了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置，用于进一步亚克隆(subcloning)或同已知的其它序列比较。◆一个15kbDNA片段的限制性酶图谱构建方法。★实验过程：首先将阳性克隆DNA分装在3个管中，分别用不同的酶及酶的组合酶切DNA。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下就可见到DNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测。★结果分析●从凝胶电泳结果可见，用NotⅠ酶切产生二条带，用SalⅠ酶切也产生二条带。根据模式Ⅱ预计的三个片段长度与实验结果一致，因此模式Ⅱ就是这个15kbDNA片段用上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。●采用类似的方法，将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。（1）限制性酶图谱◆采用类似的方法，可将不同DNA用限制性酶消化，根据其产生的多型性，即限制性酶片段长度的多型性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)，来分析DNA水平的变异程度，以RFLP作为分子标记进行基因组图谱分析。◆此外，上述经NotⅠ或SalⅠ消化的片段，可以亚克隆到pUC18等质粒上，进一步用于限制性图谱分析或序列测定。（1）限制性酶图谱（2）核酸分子杂交——Southern杂交(Southernblotting)◆将DNA用限制性酶酶切→酶切DNA电泳→变性→转移到膜上→经过标记的DNA探针与膜上的DNA片段杂交→洗去膜上非特异性结合的探针→检测杂交信号。◆如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。在筛选基因库得到阳性克隆后，往往是将限制性酶酶切与Southern杂交结合起来，绘制限制性酶图谱。（2）核酸分子杂交——Southern杂交(Southernblotting)（4）核酸序列分析◆测定的核酸序列是不是所需要的基因，或具有什么功能，还要用计算机软件或生物学实验进一步分析，才能最后得出结论。●同源性比较。可将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较，或将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较，明确测得的序列与所有的已知序列之间的同源程度。●分析核酸序列的阅读框架。一个ORF就是一段能编码一条多肽链，并通常具有翻译起始信号以及一种终止信号的核苷酸序列。◆对于那些同已知序列无任何同源性的新序列，可能还要进行基因功能性研究。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因

◆聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是体外快速扩增DNA的方法。

◆

PCR反应包括三个步骤：

●变性：在94-95℃使模板DNA的双链变性成单链。

●复性：两个引物分别与单链DNA互补复性，复性的温度在50-60℃

●延伸：在引物的引导及Taq酶的作用下，于72℃合成模板DNA的互补链

◆

这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有25-35个循环。

(三)人工合成基因

◆根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。◆例如，首先化学合成多个含有80-100个核苷酸的寡核苷酸，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重叠序列(图9－16)，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段。目的基因与载体连接(DNA分子重组)DNA分子重组目的基因导入受体五基因工程的应用(一)基因工程工业◆在动物体内胰岛素是胰腺细胞先形成一种前体胰岛素，再加工成两条不同的成熟胰岛素原分子，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，经两对二硫键连接形成成熟的胰岛素。(二)植物基因工程1.根癌农杆菌介导的植物转化◆植物基因转化是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。◆根癌农杆菌介导的植物转化◆除草剂glyphosate，是通过抑制叶绿体中的EPSP合成酶而杀死杂草的。如果EPSP合成酶遭到glyphosate的破坏，会使一些关键氨基酸的合成受阻，导致植物枯萎、死亡◆利用从抗glyphosate的大肠杆菌中分离、克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂glyphosate转基因植物。2.基因枪转化技术

◆通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，并整合到染色体上的方法。◆这种转化方法已广泛用于转化水稻、小麦、玉米、大豆等主要作物。基因枪技术还用于转化微生物、动物细胞、动植物器官、细胞器和正在生长的植物。另外，基因枪在多基因共转化中更表现出极大的优越性。(三)转基因动物

与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢一些。

◆例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。人类抗胰蛋白酶基因缺失导致的肺气肿，属于一种先天性遗传疾病。◆将人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达。将这个嵌合基因注射到已授精的羊的合子中，再放植到母羊体内，产下的转基因羊发育正常。交配后产生的羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶(每升35克)，这一结果说明可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。(四)遗传疾病诊断RFLP法RFLP法(四)遗传疾病诊断2.等位基因特异寡核苷酸法

(五)基因治疗

◆利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(genetherapy)。◆目前已有几种基因治疗方法。其中最常用的基因转移治疗方法是利用减毒的病毒DNA(retrovirusDNA)作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组减毒病毒感染患者的细胞，将正常基因