医学免疫学检验免疫荧光技术课件

医学免疫学检验免疫荧光技术课件免疫荧光技术简介|扫瞄次数：416|时间：xx-2-22PriCells-免疫荧光技术〔Immunofluorescencetechnique〕1941Coons以荧光物质标记抗体而进展抗原定位的技术称为荧光抗体技术〔fluorescentantibodytechnique〕。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度性缺乏，技术程序也还比较简单。一、荧光免疫技术的概念：免疫荧光技术〔Immunofluorescencetechnique〕又称荧光抗体胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。二、荧光免疫技术分类：荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反响后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生：物质吸取外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。由光激发所引起的荧光，为光致荧光；由化学反响所引起的荧光，为化学荧光。四、荧光素的荧光特性：停顿供能，荧光现象随即终止波长/吸取光的光量子数荧光猝灭现象：荧光素的辐射力量减弱五、常见荧光素：(fluoresceinisothiocyanate,FITC)：FITC优良。FITC389.4490～495nm，最大520～530nm，呈现光明的黄绿色荧光。FITC黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸取光波长为570nm，595～600nm，呈现橘红色荧光。四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamine550nm620nm，呈现橙红色荧光，与FITC或比照染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。3〔Eu3〕、铽中以Eu3Eu3围窄，荧光衰变时间长，最适合用于区分荧光免疫测定。240kD564nm488nm576nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推举使用585±21nm575±13nmFL2PE。多甲藻叶绿素蛋白〔peridininchlorophyllprotein，PerCP〕：PerCP488nm677nm。FL3器检测PerCP。碘化丙啶〔propidiumiodide，PI〕：可选择性地嵌入核酸〔DNA、RNA〕的双螺旋碱基对中。在对DNARNaseRNA对DNA488nm长激发下，PI610-620nm。FL2PI。常见荧光素的特性：FIT490~495nRB200570nm，放射光595~600nm，橘红色荧光。TRITC：紫红色粉末，吸取550nm，放射光620nm，橙红色荧光。、TbPE：490～560nm595nm，红色荧光。其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：B-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA317414酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶β4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光360nm450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲3(Eu3+)、铽(Tb3+)等的螯合物可放射特征性的荧光，而且激发光波长范围宽、放射光波长范围窄、荧光衰变时间长，最适合于时间区分荧光免疫测定。六、适宜荧光素的选择：具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光效率高，标记后下降不明显。荧光色泽与背风光泽比照鲜亮。标记后能保持生物学活性和免疫活性标记方法简洁、快速。安全无毒CDC一.试验原理细胞外表抗原与相应的抗体〔IgG1~3或IgM〕特异性结合形成的穿孔。因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳1暴露胸腔，分别出胸腺↓镊子夹住胸腺反复轻轻研磨↓单个细胞PBS1000rpm，10min↓参加5%小牛血清PBS3-4×107/ml三.结果推断0-10%可11-20%21-50%51-80%81-100%四.结果记录表格记录照片展现五.争论LC。抗膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成蓝色，呈阳性反响。说明CDC。LC。由于无抗原和补体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复合物，不能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能被染成蓝色，呈阴性反响。说明CDC③.第③组呈阴性的缘由：试验中参加LC体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反响。说明CDC④.第④组呈阴性的缘由：试验中只参加LC，既无抗原抗体免疫呈阴性反响。说明CDC免疫学诊断技术军事医学科学院附属医院陈建魁主要内容：第一节其次节第三节第四节第五节第六节抗原抗体反响第一节抗原抗体反响123、可逆性抗原抗体反响的特异性：结合反响的专一性即特异性。抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity)或亲合力(avidity)来表示。亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原打算基之间的结合强度。亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。适合比例性：抗体含量抗原含量前带等价带后带在抗原抗体特异性反响时，当抗原与抗体到达最适比例时，沉淀物形成最多。假设抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。消灭在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。抗体过剩抗原抗体比例适宜抗原过剩网格学说〔latticetheory〕可逆性：Ag+AbK〔亲和常数〕=AgAb抗原抗体反响的影响因素12、酸碱度〔pH:6～8〕3、温度〔37～42℃〕抗原抗体反响类型：依据抗原性质、消灭结果的现象、参与反响成分的不同，可将抗的抗原抗体反响等颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合后形成凝集团块，(agglutinationug/ml直接凝集反响细菌或红细胞等颗粒性抗原抗体正向间接凝集反响载体颗粒γ球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的抗人γ球蛋白的抗体(类风湿因子)。反向间接凝集反响载体颗粒抗体可溶性抗原(precipitation)。液相沉淀反响絮状沉淀反响环状沉淀反响免疫比浊法：越高，可依据标准曲线计算出样品中的抗原含量。该法快速简便，可取代免疫集中法测定Ig凝胶内沉淀反响免疫集中技术免疫电泳技术AgAbAg其次节免疫学检测常用的标记技术免疫标记技术(immunolabellingtechnique射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白)作为示踪快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观看、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。依据标记物与检测方法不同，标记技术可分为:金标记技术主要的免疫标记物FITC〔PE〕3H、51Cr、32P125I、131IHRP、APLuminol金属颗粒胶体金用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反响，(一)免疫荧光显微技术12间接3补体结合免疫荧光法行再用荧光素标记的抗补体抗体进直接法间接法补体法双标记法(二)流式细胞术(flowcytometry，FCM)选收集。FCMDNA、RNA、蛋白质和技术。(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay，FIA)荧光偏振免疫测定：(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)荧光物质经偏振光蓝光照耀而跃入激发态，在恢复至基态后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样品中待测物质的浓度。主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定。(time-resolvedfluoro-immunoassay，TR-FIA)并利用时间区分荧光延缓测量时间，可以消退非特异性本底荧酶联荧光免疫测定(enzymelinkedfluoro-immunoassay，ELFIA)放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素标记抗原或抗体进展免疫学检测的技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反响的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml125I131I。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE等。三、免疫酶标技术以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测，通过酶催化底物显色，量。(一)酶免疫组织化学技术(enzymeimmunohistochemistry,EIH)物酶的底物二氨基联苯胺(DAB)的分解产物适于电镜观看。常用的方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin–biotin-peroxidaseplex，ABC)，过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP)和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(APAAP)。(二)酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)1.非均相酶免疫测定(heterogeneousenzymeimmunoassay)作为吸附抗体(或抗原)的载体，可分为固相EIAEIA法。其检测的敏感度达ng~pg/mlEIA免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，此法NC酶联板上，参加待检标本，标本中假设含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，参加抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标2免疫印迹法(Immunoblotting)：它将凝胶电泳与固相免疫结合，用于检测病毒的抗体或抗原。免疫PCR(immuno-PCR，IM-PCR)酶链反响(PCR)的敏感性相结合的免疫学检测技术。★首先用连接分子(如biotin)DNA与吸附在固相载体上的待测抗原结合，形成抗原-抗体-DNA物；然后用特异性引物对DNAPCR定量测定与DNAELISA不同的是用DNA记，通过观看PCR2.均相酶免疫测定(homogeneousenzymeimmunoassay，HEI)将四、发光免疫技术发光免疫测定(luminescenceimmunoassayLIA)是将发光系统1.化学发光免疫测定(chemiluminesceneeimmunoassay，CLIA)以化学发光剂(如鲁米诺、吖啶酯等)标记抗体或抗原，免疫反响完2.生物发光免疫测定(bioluminescenceimmunoassay，BLIA)虫荧光素)或参与生物发光反响的关心因子(如ATP、NAD3.化学发光酶免疫测定(chemiluminescenceenzymeimmunoassav，CLEIA):反响步骤与酶免疫测定一样，酶促反响所用的底物为发光剂4.电化学发光免疫测定(ECLIA)，该〔electrochemiluminescence，ECL)发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2〔TPA〕[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，不稳定，自发地失去一个质子〔H+〕，TPA*，这是一种格外强的复原剂。可将三价的[Ru(bpy)3]3+复原成激发态的二价[Ru(bpy)3]2+*[Ru(bpy)3]2+*成二丙胺和丙醛。这一过程在电极外表周而复始地进展，产生很多五、免疫金标记技术免疫金标记技术(immunogoldlabellingtechnique)是以胶体金作为示踪标志物用于抗原抗体反响检测。胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞外表和组织切片中的抗原或受体，并可在一般光学显(immunogoldstaining，IGSIGS疫金银染色法(immunogoldsilverstaining，IGSS)。第三节免疫细胞的检测一、免疫细胞的分别与纯化(一)白细胞的分别血液中红细胞与白细胞的比例约为600～1000:1，两类细胞比重(密度)不同，沉降速度各异，可承受下述方法分别。1.自然沉降法:承受肝素抗凝静脉血，由于红细胞的沉降2高分子聚合物(如明胶、状分散，加速其沉降，从而更易与白细胞分别。(二)外周血单个核细胞的分别外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)指淋巴1.075～1.090；红细胞和多核白细1.0921.030～1.0351.聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque，F-H1.077次的液体和细胞区带，从而分离出PBMC。分别动物MNC1.084～1.0871.080PercollPercoll(PVP)处理的(1)连续密度梯度离心法：Percoll层液形成一个从管底到液面密度渐渐递减的连续密度梯度，可将密(2)不连续密度梯度离心法：将Percoll液和HanksPBMC的各细胞组分。(三)淋巴细胞的纯化与亚群分别PBMC如下分别方法。1.去除红细胞:用无菌蒸馏水低渗裂解或0.83%2PBMCFCSPBMC去除单核细胞和粒细胞(1)黏附法：单核细胞和多核白细胞具Sephadex(2)噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细