六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

：杜标炎，张爱娟，谭宇蕙，易华，吴映雅，郭玉荣

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六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

字2024A014；环境合格证号NO0010470］，由广州中医药高校试验动物中心供应。

14GCV杀伤敏感性及GCV工作浓度的确定［10］大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-和CBRH7919/tk+铺96孔培育板；在铺板24h后加入梯度浓度GCV，MTT法测定细胞对GCV的敏感性，确定GCV的工作浓度为392μmol/L。

15六味地黄丸含药血清和空白血清的制备及血清对细胞生长的影响［10］16只SD大鼠随机分为2组，空白血清组灌胃生理盐水，六味地黄丸含药血清组灌胃六味地黄丸（32g·kg-1·d-1），制备4d和8d血清

，-70℃冰箱保存备用。观测空白血清和含药血清对细胞生长的影响，结果表明血清能在肯定程度上促进细胞增殖，但当血清浓度高于体积分数20%时细胞形态消失变化，故试验时采纳对细胞生长影响较小的体积分数10%以下的血清浓度。

16自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对肝癌细胞的杀伤效应将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-按1∶9的细胞数混合，作为自杀基因tk/GCV系统作用的细胞；没有自杀基因系统的试验组，其作用细胞均为tk-细胞，按3×103个/孔铺96孔板，分为空白血清组、GCV加空白血清组、10%tk+/GCV加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组；灌胃8d含药血清又再分为低剂量组（25%含药血清+75%空白血清）、中剂量组（5%含药血清+5%空白血清）和高剂量组（10%含药血清），共设12组，每组6个复孔；灌胃4d含药血清则分为低剂量组（5%含药血清+5%空白血清）和高剂量组（10%含药血清），共设9组，每组6个复孔；血清浓度均为体积分数。用完全培育基培育24h后，加入相应空白血清和含药血清，孵育12h，再加入终浓度392μmol/L的GCV，培育60h后，以MTT法检测细胞活性。

17统计学分析和协同性分析采纳SPSS115统计软件，多组间两两比较用OneWayANOVA,LSD法。协同性分析用金正均Q值法推断［13］，Q=试验联合药效R’（A+B）/理论联合药效R（A+B），理论联合药效R（A+B）=RA+RB-RA×RB，RA、RB为单独用药药效。Q＜085则推断为拮抗作用；085≤Q＜115则推断为相加作用；Q≥115则推断为协同作用。

2结果

21自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（4d）对肝癌细胞的杀伤效应空白血清组、含药血清组、GCV加空白血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显的细胞毒性，表明在试验条件下血清和GCV对肿瘤细胞的生长无明显影响。自杀基因系统10%tk+/GCV加空白血清组及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有显著杀伤作用（与空白血清组比较，Ｐ＜００５），表明自杀基因系统具有生物学功能；10%tk+/GCV系统联合5%、10%含药血清组的细胞存活率均显著低于10%tk+/GCV加空白血清组（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）及相对应的含药血清组，联合组的实际抑制率均显著高于理论抑制率，Q值分别为116、149，均大于115，说明其相互作用具有协同性，且随着含药血清浓度的增高Q值增大，协同作用增加。结果见表1。

22自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（8d）对肝癌细胞的杀伤效应10%tk+/GCV自杀基因治疗系统联合25%、5%、10%浓度的含药血清，细胞存活率均显著低于含药血清组与10%tk+/GCV加空白血清组（Ｐ＜００５或Ｐ＜００1）。联合组的实际抑制率均显著高于理论抑制率，Q值分别为086、120、142。但25%的含药血清联合组的Q值在085~115之间，为相加作用；而5%、10%浓度联合组均Q＞115，说明其增效作用具有协同性，且随着含药血清浓度的增高协同作用增加。结果见表2。表1自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清（4d）对肝癌细胞的杀伤效应表2六味地黄丸含药血清（8d）联合10%tk+/GCV系统对CBRH7919作用的杀伤效应

3争论

自杀基因治疗之所以能成为恶性肿瘤基因治疗的研

六味地黄丸对自杀基因系统杀伤肝癌细胞增效作用的量效关系

究热点和最有应用前景的肿瘤基因治疗方法，是由于自杀基因治疗存在旁杀伤效应（或称为旁观者效应）的独特机制。所谓旁杀伤效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［1-2］。旁杀伤效应形成机制的假说主要包括［14］：（1）“缝隙连接”机制；（2）免疫介导机制；（3）“细胞凋亡”机制；（4）介质机制；（5）抗肿瘤血管生成等。由于在整体水平基因转染效率很低，同时病毒载体的使用也带来了肯定的毒副作用，故自杀基因疗法存在旁杀伤效应这一独特的作用机制具有很多优势，如能削减对高转染率的要求，削减载体过量引起的毒副作用等。但在目前的状况下，由于体内转染效率较低等缘由，使肿瘤自杀基因治疗的效果仍不非常令人满足。以增加旁杀伤效应为目标的联合治疗是目前肿瘤自杀基因治疗的讨论热点之一。现有中药方药药理作用的讨论结果提示：中药方药有可能针对自杀基因旁杀伤效应的机制，通过增加自杀基因旁杀伤效应对肿瘤自杀基因疗法产生协同作用。我们前期的动物在体试验讨论表明，自杀基因疗法联合滋阴补肾中药名方六味地黄丸能更有效地抑制小鼠移植性肝癌的生长［9］。初步的体外试验结果也表明，自杀基因疗法联合滋阴补肾中药名方六味地黄丸含药血清在自杀基因系统杀伤肝癌细胞时发挥协同作用［10］。本试验结果显示：在大鼠血清总浓度为10%的条件下，六味地黄丸灌胃4d的含药血清在50%、10%含药血清浓度下，与自杀基因系统联合作用的抑制率为2151%、2878%，较单纯自杀基因系统的抑制率1449%分别提高了702%、1429%；六味地黄丸灌胃8d的含药血清，在25%、50%、10%浓度下，与自杀基因系统联合作用的抑制率为2666%、3214%、3089%，较单纯自

杀基因系统的抑制率2193%分别提高了47%、102%、90%，呈现剂量依靠关系。结果表明六味地黄丸能增加自杀基因疗法对肝癌细胞的杀伤效应。我们还比较了4d含药血清和8d含药血清的增效作用效果，结果显示无显著性差异，提示灌胃4d含药血清即可满意试验要求。

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［10］杜标炎,张爱娟,谭宇蕙,等.自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用［J］.广州中医药高校学报,2024,25(4):319.

［11］杜标炎,谭宇蕙,吴映雅,等.逆转录病毒载体介导HSV1tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建［J］.广州中医药高校学报,2024,21(5):395.

［12］谭宇蕙,吴映雅,杜标炎,等.大鼠肝癌细胞HSVt