蛋白沉淀反应

蛋白沉淀反应第一页，共十三页，编辑于2023年，星期五ʺ实验目的

⃔了解蛋白质的两性解离性质

⃔学习测定蛋白质等电点的一种方法

⃔加深对蛋白质溶液稳定因素的认识⃔了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义第二页，共十三页，编辑于2023年，星期五₪蛋白结构改变可导致其溶解度发生改变◆

在pH>pI时，蛋白带负电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状◆

在pH<pI时，蛋白带正电，蛋白分子相互排斥,蛋白呈溶解状态ʺ实验原理◆

在pH=pI时，蛋白不带电，蛋白溶解度最低(注:不一定沉淀)⃑⃑

蛋白的可逆沉淀:结构可以恢复(非变性)⃑蛋白带电性质的改变所引起的溶解度发生改变第三页，共十三页，编辑于2023年，星期五⃑⃑

蛋白的不可逆沉淀:结构不可以恢复(变性)⃑

蛋白经高温加热⃑

盐析和特定条件下的乙醇作用(低温和短时间)⃑

蛋白和重金属作用:如硝酸银⃑

蛋白和某些有机酸作用:如三氯乙酸第四页，共十三页，编辑于2023年，星期五ʺ试剂和器材

₪试剂&新鲜鸡蛋&0.4%酪蛋白醋酸钠溶液

取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40-50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。&1.00mol/L、0.10mol/L、0.01mol/L醋酸溶液第五页，共十三页，编辑于2023年，星期五&蛋白质溶液

5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清

：水=1:9）&

pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100mL3%硝酸银溶液10mL5%三氯乙酸溶液50mL95%乙醇250mL饱和硫酸铵溶液250mL硫酸铵结晶粉末0.1mol/L盐酸溶液300mL0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL0.05mol/L碳酸钠溶液300mL甲基红溶液20mL第六页，共十三页，编辑于2023年，星期五₪器材

水浴锅温度计200mL锥形瓶

100mL容量瓶

吸管

试管及试管架

乳钵第七页，共十三页，编辑于2023年，星期五ʺ实验操作₪酪蛋白等电点的测定&取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号蒸馏水0.01mol/L醋酸0.1mol/L醋酸

1.0mol/L醋酸pH混浊程度(mL)(mL)(mL)(mL)

18.40.6—

—5.928.7—0.3—5.538.0—1.0—4.747.4—

—1.63.5&4支试管中各加4%酪蛋白醋酸钠溶液1mL并马上摇匀。观察其混浊程度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。第八页，共十三页，编辑于2023年，星期五₪蛋白质的沉淀及变性

▐蛋白质的可逆沉淀

盐析:无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）能析出蛋白质。Ø加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数min,观察是否有沉淀,为什么？(沉淀为球蛋白)。Ø倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？Ø将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。观察是否有沉淀,为什么？(沉淀为清蛋白)。第九页，共十三页，编辑于2023年，星期五▐蛋白质的不可逆沉淀&重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。Ø取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1-2滴，振荡试管，观察是否有沉淀,为什么？Ø如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？第十页，共十三页，编辑于2023年，星期五&某些有机酸沉淀蛋白质Ø取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，和1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察是否有沉淀,为什么？Ø如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？第十一页，共十三页，编辑于2023年，星期五&有机溶剂沉淀蛋白质Ø取1支试管，加入4%酪蛋白醋酸溶液2mL，再加入2mL95%乙醇。观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCl，混匀)。Ø如有沉淀产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？第十二页，共十三页，编辑于2023年，星期五&乙醇沉淀蛋白质Ø取3支试管，取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂,摇匀并观察是否有沉淀生成：试管号蛋白溶液0.1mol/LNaOH

0.1mol/LHCl

95%乙醇

pH4.7

(mL)(mL)(mL)(mL)缓冲液(mL)11—

—11211—1—

31—11—

Ø以上3支试管再分别加入以下试剂,观察颜色和沉淀现象试管号水甲基红0.1mol/L醋酸0.05mol/L碳酸钠0.1mol/LHCl

(mL)(滴)18—

—

—

—

281滴(