色谱法分离原理1

19.1概述

1903年，俄国植物学家MikhailTswett采用填充有固体CaCO3细粒子的玻璃柱，将植物色素的混合物(叶绿素和叶黄素)加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱。

静止不动的一相（固体或液体）称为固定相运动的一相（气体、液体或超临界流体）称为流动相装有固定相的柱子称为色谱柱本文档共43页；当前第1页；编辑于星期一\1点53分色谱分类方法：按固定相外形分：柱色谱（填充柱、空心柱）、平板色谱，又可分为薄层色谱和纸色谱。2.按组份在固定相上的分离机理分：吸附色谱：不同组份在固定相的吸附作用不同；分配色谱：不同组份在固定相上的溶解能力不同；离子交换色谱：不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；凝胶色谱（尺寸排阻色谱）不同尺寸分子在固定相上的渗透作用。本文档共43页；当前第2页；编辑于星期一\1点53分3.按两相状态分本文档共43页；当前第3页；编辑于星期一\1点53分概念：迎头色谱、顶替色谱和洗脱色谱ABABCABCABCACsCm123迎头色谱样品溶液本身是流动相顶替色谱流动相吸附能力强洗脱色谱流动相吸附能力弱根据组分在两相间的浓度关系是否线性，分线性洗脱色谱和非线性洗脱色谱本文档共43页；当前第4页；编辑于星期一\1点53分19.2线性洗脱色谱及相关术语洗脱色谱分离原理

在色谱法中，当样品加入后，样品中各组分随着流动相的不断向前而在两相间反复进行溶解、挥发，或吸附、解吸，如果各组分在固定相中的分配系数不同，它们就有可能达到分离。本文档共43页；当前第5页；编辑于星期一\1点53分一、基线：在实验条件下，色谱柱后仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线称为基线，S/N大的、稳定的基线为水平直线。二、峰高：色谱峰顶点与基线的距离。三、保留值(Retentionvalue)本文档共43页；当前第6页；编辑于星期一\1点53分a.保留时间tR：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组分随流动相通过柱子的时间和组分在固定相中滞留的时间。b.死时间(Deadtime,tM)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据tM可求出流动相平均流速注：早期保留值也用记录纸上的距离表示，利用走纸速度可换算为时间本文档共43页；当前第7页；编辑于星期一\1点53分c.调整保留时间tR’：某组分的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组分在固定相中的滞留时间。即tR´=tR

tm由于时间为色谱定性依据。但同一组分的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。d.保留体积VR：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。本文档共43页；当前第8页；编辑于星期一\1点53分e.死体积VM：f.调整保留体积：g.相对保留值g2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。

注意：γ2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据！选一对最难分离的物质，此时以a表示：

a又称选择因子，a

>1

本文档共43页；当前第9页；编辑于星期一\1点53分h.分配系数(K)：

描述组份在固定相和流动相间的分配过程或吸附-脱附过程的参数，称为分配系数。K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。i.分配比(k)：在一定温度和压力下，组分在两相间的分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比(或摩尔数比），称为分配比,又称保留因子。其中VM流动相体积，Vs为固定相体积本文档共43页；当前第10页；编辑于星期一\1点53分

分配比k的求算：

流动相线速为u,试样带线速度为us,而所以本文档共43页；当前第11页；编辑于星期一\1点53分K与k的关系：

b称为相比，它也是反映色谱柱柱型特点的参数。对填充柱，b；对毛细管柱，b。选择因子α：色谱柱对A、B两组分的选择因子α定义如下：A为先流出的组分，B为后流出的组分。本文档共43页；当前第12页；编辑于星期一\1点53分a和k是计算色谱柱分离效能的重要参数：

K或k反映的是某一组分在两相间的分配；而a是反映两组分间的分离情况当两组分K或k相同时，a=1

时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，a越大，分离得越好。即两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。

本文档共43页；当前第13页；编辑于星期一\1点53分四、区域宽度：用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：

标准偏差σ：0.607倍峰宽处的一半。半峰宽Y1/2：峰高一半处的峰宽。Y1/2=2.354σ峰底宽Y：色谱峰两侧拐点上切线与基线的交点间的距离(Y=4σ)若标准偏差以时间为单位，用t表示，s和t的关系:

此处s为色谱柱内区带的标准偏差，L为柱长（见后）本文档共43页；当前第14页；编辑于星期一\1点53分

(1)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数．(2)根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析．(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析．(4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据．(5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据本文档共43页；当前第15页；编辑于星期一\1点53分一、塔板理论1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。19-3色谱法基本理论前提：1、两组分的分配系数必须有差异2、区域扩展速率小于区域分离速率本文档共43页；当前第16页；编辑于星期一\1点53分塔板理论假定：1）塔板之间不连续；2）塔板之间无分子扩散；3）组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4）某组分在所有塔板上的分配系数K相同；5）流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。本文档共43页；当前第17页；编辑于星期一\1点53分分离过程本文档共43页；当前第18页；编辑于星期一\1点53分本文档共43页；当前第19页；编辑于星期一\1点53分本文档共43页；当前第20页；编辑于星期一\1点53分色谱流出曲线的数学描述当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；当塔板数n>50时，峰形接近正态分布。色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为：本文档共43页；当前第21页；编辑于星期一\1点53分由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：

理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。若柱长为L，则每块理论塔板高度H为理论塔板数n越多或理论塔板高度H越小、色谱峰越窄，则柱效越高。本文档共43页；当前第22页；编辑于星期一\1点53分前述两式包含死时间tM，它与组分在柱内的分配无关，因此不能真正反映色谱柱的柱效。通常以有效塔板数neff

和有效塔板高度Heff表示：本文档共43页；当前第23页；编辑于星期一\1点53分二、速率理论1956年，荷兰化学工程师vanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，给出了vanDeemter方程：u为流动相线速度；A，B，C为常数，其中A—涡流扩散系数；B—分子扩散系数；C—传质阻力系数（包括液相和固相传质阻力系数）。

该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素，任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。本文档共43页；当前第24页；编辑于星期一\1点53分1）涡流扩散项(A)展宽程度以A表示：

其中dp—填充物平均直径；λ—填充不规则因子。可见，使用细粒的固定相并填充均匀可减小A，提高柱效。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。本文档共43页；当前第25页；编辑于星期一\1点53分2）分子扩散项(B/u)浓度梯度而向前后自发地扩散，使谱峰展宽。其大小为γ—称为弯曲因子，它表示固定相几何形状对自由分子扩散的阻碍情况；D—组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或液体时，分别以Dg或Dm表示；本文档共43页；当前第26页；编辑于星期一\1点53分3）传质阻力项(C·u)

因传质阻力的存在，使分配不能“瞬间”达至平衡，因此产生峰形展宽。a）气液色谱：传质阻力项C包括气相传质阻力系数Cs和液相传质阻力系数Cl。本文档共43页；当前第27页；编辑于星期一\1点53分本文档共43页；当前第28页；编辑于星期一\1点53分b）液液色谱：传质阻力项C包括流动相传质阻力系数Cm和固定相传质阻力系数Cs。本文档共43页；当前第29页；编辑于星期一\1点53分4）流速u

由vanDeemter方程H=A+B/u+C·u知道：

以u对H作图，可得H-u曲线（如图），从该曲线得到：本文档共43页；当前第30页；编辑于星期一\1点53分本文档共43页；当前第31页；编辑于星期一\1点53分19.4分离度及色谱分离方程一、分离度(Resolution,R)

同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标。也称总分离效能指标或分辨率。其定义为：

利用此式，可直接从色谱流出曲线上求出分离度R。R越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。本文档共43页；当前第32页；编辑于星期一\1点53分本文档共43页；当前第33页；编辑于星期一\1点53分二、色谱分离方程

对于相邻的难分离组分，由于它们的分配系数K相差小，可合理假设k1≈k2=k，Y1

≈Y2=Y。因此可导出R与n、a和k的关系：本文档共43页；当前第34页；编辑于星期一\1点53分分离度R与选择因子α的关系

α越大，柱选择性越好，对分离有利。α的微小变化可引起R较大改变。如，当α从1.01增加至1.10(增加9%)时，R则增加9倍(但α>1.5,R增加不大)。

改变α的方法有：降低柱温、改变流动相及固定相的性质和组成。分离度R分配比k的关系

k增加，分离度R增加，但当k>10，则R的增加不明显。通常k在2-10之间。

改变k的方法有：适当增加柱温(GC)、改变流动相性质和组成(LC)以及固定相含量。本文档共43页；当前第35页；编辑于星期一\1点53分19.5色谱定性和定量分析一、色谱定性鉴定方法1.利用纯物质定性的方法

利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。2.相对保留值定性

利用相对保留值g21定性3.加入已知物增加峰高法

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。本文档共43页；当前第36页；编辑于星期一\1点53分4.保留指数又称柯瓦指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：本文档共43页；当前第37页；编辑于星期一\1点53分保留指数计算方法本文档共43页；当前第38页；编辑于星期一\1点53分二、色谱定量分析方法1.峰面积的测量

（1）峰高（h）乘半峰宽（Y1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：

A=1.065h·Y1/2（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：

A=h·（Y0.15+Y

0.85）/2

本文档共43页；当前第39页；编辑于星期一\1点53分2.定